古朵生物解析:細胞分離的常見問題解答
原代細胞（Primary cells）：是指直接從機體取出的組織或細胞獲得單個細胞并在體外進行培養的細胞。這里的組織主要指：組織器官、外周血及胚胎等。
原代細胞培養：由于原代細胞生長緩慢，繁殖一定的代數停止生長（一般10代以內）。所以一般認為：培養的原代的第1和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。
細胞分離的常見問題解答：
Q：為什么我取得原代腫瘤組織，分離的卻不是腫瘤細胞？
A：取材時，我們要熟悉所需組織的類型和部位特征，選擇腫瘤細胞集中、活力較好的部分。避免結締等正常組織。
Q：若是細胞中混成纖維細胞，如何去除？
A：成纖維細胞的去除對于腫瘤細胞培養十分重要。由于成纖維細胞貼壁速度較腫瘤細胞快，可利用反復貼壁法使二者分離，進而達到清除成纖維細胞的目的。
Q：為什么離心后，沒有細胞分離出來？
A：需要考慮消化酶的因素，由于腫瘤組織較致密，胰酶無法消化，一般選用膠原酶，如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結合機械法，如研磨或者攪拌加速細胞分散。如下表為二者的區別：
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膠原酶 |
胰酶 |
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來源 |
細菌 |
胰臟 |
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消化組織 |
纖維多的硬組織 |
軟組織 |
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對細胞影響 |
傷害小 |
長時間有損傷 |
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作用力度 |
緩和 |
強 |
注：膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，根據分離的組織類型需選擇合適的膠原酶類型。
Q：消化時間如何確定？
A：具體的消化酶的量和消化時間可根據組織類型和多少進行調整。
Q：消化之前為什么用EDTA?
A：EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑，對一些組織，尤其是上皮組織分散效guo好。與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物后，形成的機械力可使細胞分散。
Q：細胞量太少，長不起來怎么辦？
A：有幾種辦法，如對沒消化完的組織塊反復消化，盡量多收集一些細胞；并且盡量傳代到小皿里，如6孔板都可以。若是細胞仍太少，應耐心等待，盡量不要傳代，只換液。
Q：細胞難以貼壁？
A：盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養能否成功的關鍵。為了盡快促進細胞貼壁，可以提前1h將千分之的明膠鋪于培養板。
Q：腫瘤原代細胞培養方法與細胞系不同之處在哪里？
A：培養基一般選用RPM1640，DMEM等，建議Z好能加入促生長的物質：如胰島素、氫化可的松、雌激素、EGF等因子。
Q：皮膚組織作為正常組織，與腫瘤組織分離主要區別在哪里？
A：先，皮膚組織需要用中性分離酶dispaseII將表皮分離出來；其次，在消化時，用的是胰酶，而非膠原酶，并且胰酶的濃度用的是0.05%，而不是0.25%。
Q：表皮的分離需要注意什么？
A：表皮一般可以完整的撕脫下來，溫度的變化，孵育的時間以及所用的酶的濃度都會影響表皮是否能完整剝離。
Q：為什么需要無Ca血清來終止消化？
A：因為Ca2+的濃度可以影響角質形成細胞的生長，并且培養時必須嚴格調控培養基中的Ca2+濃度。
