三代測(cè)序技術(shù)興起已經(jīng)不是一天兩天的事情，可是好多小伙伴對(duì)它的認(rèn)知好像僅僅限于一個(gè)名詞，沒有具體去深入了解過，以為可能就是跟現(xiàn)在的二代測(cè)序技術(shù)沒有什么差別，只是升級(jí)版而已，小編很負(fù)責(zé)任的告訴你，在你不知道的時(shí)間里，它已經(jīng)成為科研領(lǐng)域不可或缺的一種主流技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因組Denovo、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)、宏基因組、重測(cè)序和變異檢測(cè)等多個(gè)方向，并且在染色體結(jié)構(gòu)變異（SV）的檢測(cè)中有著不可替代的。

特別是隨著近兩年 eccDNA（extrachromosomal circular DNA）即染色體外環(huán)狀DNA成為科研界的寵兒，三代測(cè)序技術(shù)geng是被推上了浪潮的。

第三代測(cè)序技術(shù)主要有兩大技術(shù)：

第1是單分子實(shí)時(shí)熒光測(cè)序，脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度；當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)在DNA鏈上被探測(cè)到；當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）可以通過檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間，來檢測(cè)一些堿基修飾情況，即如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時(shí)的速度會(huì)減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個(gè)來直接檢測(cè)甲基化等信息

（2）測(cè)序速度很快，每秒約10 個(gè)dNTP

（3）讀長(zhǎng)長(zhǎng)（約50kb）：超長(zhǎng)讀長(zhǎng)可獲得mRNA全長(zhǎng)序列及完整結(jié)構(gòu)信息，提高拼接效率，轉(zhuǎn)錄本無需拼接；克服無參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接短、信息不完整的難題；實(shí)現(xiàn)有參考基因組物種研究可變剪切及融合基因等結(jié)構(gòu)變異。精-準(zhǔn)重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組/基因組全貌

（4）直接對(duì)原始DNA/RNA樣本測(cè)序，無需PCR擴(kuò)增，無GC偏好性

（5）需要的樣品量很少，樣品制備時(shí)間花費(fèi)少

缺點(diǎn)：

（1）測(cè)序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通病），達(dá)到15%

好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在測(cè)序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測(cè)序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)

（2）依賴DNA聚合酶的活性

（3）成本比二代測(cè)序較高

第二是納米孔測(cè)序，納米孔測(cè)序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔來實(shí)現(xiàn)測(cè)序的；由于納米孔的直徑非常小，僅允許單個(gè)核苷酸聚合物通過，而ATCG單個(gè)堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號(hào)的變化差異就能檢測(cè)出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序。

優(yōu)點(diǎn)：

（1） 測(cè)序讀長(zhǎng)：大約在幾十kb，甚至100 kb，理論上只要DNA分子不斷開就可以一直通過納米孔（比如很火的eccDNA，往往比較大，并且往往攜帶多個(gè)染色質(zhì)來源的序列，因此僅用二代測(cè)序很難完整構(gòu)建出eccDNA的全長(zhǎng)序列。三代測(cè)序技術(shù)顯著提高了測(cè)序中分子讀長(zhǎng)的問題，可以用于eccDNA的全長(zhǎng)序列鑒定）

（2） 可以直接讀取甲基化的胞嘧啶，不必像二代測(cè)序那樣需要對(duì)基因組進(jìn)行bisulfite處理（怎么理解：也就是用三代測(cè)序做一個(gè)全基因組測(cè)序的話，可以同時(shí)有DNA甲基化的數(shù)據(jù)分析）

（3） 測(cè)序通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);

（4） 起始DNA在測(cè)序過程中不被破壞;

（5） 以及樣品制備簡(jiǎn)單又

缺點(diǎn)：

（1） 測(cè)序準(zhǔn)確率：Nanopore測(cè)序準(zhǔn)確率和Pacbio持平，為86%左右。而且起始位置正確率偏低，在大約100nt位置達(dá)到穩(wěn)定，且錯(cuò)誤為隨機(jī)測(cè)序錯(cuò)誤。如果是對(duì)DNA正負(fù)鏈都進(jìn)行測(cè)序，可以達(dá)到96%的準(zhǔn)確率

（2） 切斷的核苷酸可能被讀錯(cuò)方