植物體內脫落酸、赤霉素的分離和測定
在研究植物生命活動過程中，常常需要準確了解某一激素的含量以及各激素間的比例。因此，植物內源激素的提取分離和測定是植物生理學實驗技術中其重要的內容。本實驗以ABA和GA為例，介紹激素的提取、分離及測定的基本原理和方法。
一、原理
利用脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有機溶劑（如丙酮、甲醇）的特性進行提取，將粗提物經過一系列的分離技術（如萃取、薄層層析或紙層析等），使ABA、GA與其它成分分離。再對純化的ABA和GA進行生物學鑒定或物理化學鑒定。
（一）生物鑒定1.ABA能抑制植物器官的生長，在一定的濃度條件下，其抑制程度與濃度呈線性關系。利用這一線性關系就可確定組織中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的節間伸長，特別是矮生植物的莖。在一定濃度范圍內，莖的伸長度與GA濃度呈線性關系。因此，根據莖的伸長度就可確定GA的含量。
（二）物理化學鑒定：可采用氣相色譜法。
二、材料、儀器設備及試劑
（一）材料：植物葉片、水稻種子及幼苗等；
（二）儀器設備：1.氣相色譜儀；2.分液漏斗；3.組織勻漿器；4.旋轉蒸發干燥器；5.層析缸；6.華特曼-3號層析紙；7.微量注射器。
（三）試劑：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 異丙醇；13. 3mol/L氨水。
三、實驗步驟與結果計算
（一）脫落酸和赤霉素的提取和分離
1.樣品提?。?）取新鮮材料或貯存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待測時）10g，剪碎，加入60ml預冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，勻漿5min，勻漿液在4℃下振蕩（或攪拌）24h，過濾。殘渣再用20ml甲醇液振蕩1h。反復二次，濾液混合。（2）將濾液在旋轉蒸發器上干燥減壓蒸發（36～38℃）至原體積一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，將下層甲醇液取出，棄掉石油醚層，繼續減質濃縮至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.樣品萃取將水溶液用1mol/LHCl調pH至2.8～2.5左右。并以與水溶液等體積的乙酸乙酯萃取。將混合溶液裝入分液漏斗，分離水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此時，CTK（細胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。
3.樣品的純化（1）將乙酸乙酯溶液用旋轉蒸發器濃縮至干。用2ml100％甲醇溶解殘留物。（2）點樣：取100μl甲醇溶液點在涂有硅膠GF254玻板下端1cm處（或點在華特曼3號層析紙上），并在同一水平上分別點上標準GA和ABA溶液100μl。（3）展層：用異丙醇-28％氨水-水（10∶1∶1，V／V／V）作為展層劑展層。前沿至玻板頂端0.5cm處即停止展層。（4）定位：層析完畢后，吹干玻板并在紫外燈下觀察色帶，與標準ABA和GARf值相同或相近的色帶，就作為純化后的ABA和GA。（5）洗脫：將ABA和GA帶分別括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液經減壓蒸干后，即可進一步作生物學測定或氣相色譜測定之用。
（二）ABA和GA的測定
1.ABA的生物學鑒定
（1）材料培養：精選小麥種子，25℃黑暗下浸種2h，排于培養皿濕濾紙上，在25℃下發芽。待胚根出現后，移入培養缸中的塑料網上，繼續在25℃暗中培養。約72h后，選取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自頂端分別切成3mm，5mm，5mm三小段，取中間5mm切段置蒸餾水中2～3h，備用。
（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：稱取20mgABA，溶于少量酒精，以無離子水定容至100ml。
（3）標準溶液的配制：吸取5ml母液，加無離子水定容至100ml，即為10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0）定容至50ml，即為1μg/mlABA標準液。余此類推，分別配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml標準液。
（4）標準曲線的繪制：取2ml各種濃度的ABA標準液分別置入10ml具塞試管，每管加入小麥芽鞘切段10根。各濃度均需3～4個重復。加塞后，置暗處25℃搖床上振蕩20h。將10個切段取出測定其總長度（cm），然后按下列公式計算處理后減少的百分數（R）：R（％）＝(D空-D處理)/D原×100。
式中：D空：空白總長度；D處理：處理總長度；D原：原始總長度（5.0cm）。用R與ABA濃度的相關性，繪制標準曲線。
（5）將待測樣品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0），置具塞試中，按上述步驟操作，算出R值，再查標準曲線，就得到ABA濃度C，依下式計算出樣品中ABA含量：ABA含量（μg/g鮮重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的氣相色譜測定將洗脫的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅烷基乙酰胺）使脫落酸硅烷化。0.5h后，吸取5μl作氣相層析，層析條件：柱長2m，φ5mm（不銹鋼柱）、固定相為10％SE-30，DMCS、A、W為擔體，進樣口溫度250℃，柱溫200℃，FID檢測。載氣流速為30μl/min，采用內標法定性，外標法定量。計算：ABA含量（μg/g鮮重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)
一、原理
利用脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）能溶解于有機溶劑（如丙酮、甲醇）的特性進行提取，將粗提物經過一系列的分離技術（如萃取、薄層層析或紙層析等），使ABA、GA與其它成分分離。再對純化的ABA和GA進行生物學鑒定或物理化學鑒定。
（一）生物鑒定1.ABA能抑制植物器官的生長，在一定的濃度條件下，其抑制程度與濃度呈線性關系。利用這一線性關系就可確定組織中ABA的含量。2.GA能刺激幼嫩植物的節間伸長，特別是矮生植物的莖。在一定濃度范圍內，莖的伸長度與GA濃度呈線性關系。因此，根據莖的伸長度就可確定GA的含量。
（二）物理化學鑒定：可采用氣相色譜法。
二、材料、儀器設備及試劑
（一）材料：植物葉片、水稻種子及幼苗等；
（二）儀器設備：1.氣相色譜儀；2.分液漏斗；3.組織勻漿器；4.旋轉蒸發干燥器；5.層析缸；6.華特曼-3號層析紙；7.微量注射器。
（三）試劑：1. 100％甲醇；2. 80％甲醇；3. 石油醚；4. 乙酸乙酯；5. 1mol/LHCl；6. 硅酸GF232；7. 氯-仿；8. GA；9. ABA；10. 乙醇；11. 正丁醇；12. 異丙醇；13. 3mol/L氨水。
三、實驗步驟與結果計算
（一）脫落酸和赤霉素的提取和分離
1.樣品提?。?）取新鮮材料或貯存材料（用100％甲醇固定，放置-10℃冰箱中至待測時）10g，剪碎，加入60ml預冷（＜0℃＝的80％甲醇溶液，勻漿5min，勻漿液在4℃下振蕩（或攪拌）24h，過濾。殘渣再用20ml甲醇液振蕩1h。反復二次，濾液混合。（2）將濾液在旋轉蒸發器上干燥減壓蒸發（36～38℃）至原體積一半，再加入10ml石油醚提取部分色素，將下層甲醇液取出，棄掉石油醚層，繼續減質濃縮至水溶液。在此水溶液中含有IAA、ABA、GA和CTK等。
2.樣品萃取將水溶液用1mol/LHCl調pH至2.8～2.5左右。并以與水溶液等體積的乙酸乙酯萃取。將混合溶液裝入分液漏斗，分離水相和乙酸乙酯相。取水相再用乙酸乙酯萃取2次。合并乙酸乙酯溶液。此時，CTK（細胞分裂素）存在于水相中，而ABA、GA、IAA存在于乙酸乙酯中。
3.樣品的純化（1）將乙酸乙酯溶液用旋轉蒸發器濃縮至干。用2ml100％甲醇溶解殘留物。（2）點樣：取100μl甲醇溶液點在涂有硅膠GF254玻板下端1cm處（或點在華特曼3號層析紙上），并在同一水平上分別點上標準GA和ABA溶液100μl。（3）展層：用異丙醇-28％氨水-水（10∶1∶1，V／V／V）作為展層劑展層。前沿至玻板頂端0.5cm處即停止展層。（4）定位：層析完畢后，吹干玻板并在紫外燈下觀察色帶，與標準ABA和GARf值相同或相近的色帶，就作為純化后的ABA和GA。（5）洗脫：將ABA和GA帶分別括下（或剪下），用95％乙醇浸提3次。溶液經減壓蒸干后，即可進一步作生物學測定或氣相色譜測定之用。
（二）ABA和GA的測定
1.ABA的生物學鑒定
（1）材料培養：精選小麥種子，25℃黑暗下浸種2h，排于培養皿濕濾紙上，在25℃下發芽。待胚根出現后，移入培養缸中的塑料網上，繼續在25℃暗中培養。約72h后，選取胚芽鞘2.8～3.0cm的幼苗，用刀片自頂端分別切成3mm，5mm，5mm三小段，取中間5mm切段置蒸餾水中2～3h，備用。
（2）ABA母液（200μg/ml）的配制：稱取20mgABA，溶于少量酒精，以無離子水定容至100ml。
（3）標準溶液的配制：吸取5ml母液，加無離子水定容至100ml，即為10μg/ml。吸取5ml10μg/mlABA溶液，用2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0）定容至50ml，即為1μg/mlABA標準液。余此類推，分別配成0、0.001、0.01、0.1、1μg/ml標準液。
（4）標準曲線的繪制：取2ml各種濃度的ABA標準液分別置入10ml具塞試管，每管加入小麥芽鞘切段10根。各濃度均需3～4個重復。加塞后，置暗處25℃搖床上振蕩20h。將10個切段取出測定其總長度（cm），然后按下列公式計算處理后減少的百分數（R）：R（％）＝(D空-D處理)/D原×100。
式中：D空：空白總長度；D處理：處理總長度；D原：原始總長度（5.0cm）。用R與ABA濃度的相關性，繪制標準曲線。
（5）將待測樣品溶于2ml2％蔗糖-0.01mol/L磷酸緩沖液（pH5.0），置具塞試中，按上述步驟操作，算出R值，再查標準曲線，就得到ABA濃度C，依下式計算出樣品中ABA含量：ABA含量（μg/g鮮重）＝C（μg/ml×2×10-1/W（g）2.ABA的氣相色譜測定將洗脫的ABA加入0.1mlBSA（N.O-二-三甲基硅烷基乙酰胺）使脫落酸硅烷化。0.5h后，吸取5μl作氣相層析，層析條件：柱長2m，φ5mm（不銹鋼柱）、固定相為10％SE-30，DMCS、A、W為擔體，進樣口溫度250℃，柱溫200℃，FID檢測。載氣流速為30μl/min，采用內標法定性，外標法定量。計算：ABA含量（μg/g鮮重）＝A1×Ws×100×1/(As×5×W)
