姐妹染色單體差別染色 古朵技術√
姐妹染色單體區(qū)分染色法 (Sister chromatid differentiation ， SCD ）是 70 年代中期發(fā)展起來的染色體處理技術。 Latt （ 1973 ）在培養(yǎng)的細胞中加入 5- 溴脫氧尿嘧啶核苷（ BrdU ），當用 Hoechst33258 熒光染料染色時，發(fā)現了姊妹染色單體的色差反映和它們之間互換的現象。
1974 年 KO Renberg 和 Froeed-Lender 改進了這一技術，建立了較簡易的 BrdU-Giemsa 技術。這種技術用于研究細胞周期、染色體半保留復制、染色體的分子結構和畸變，以及 DNA 的復制、損傷與修復等一系列重要理論問題，還可以用于分析姊妹染色單體互換（ Sister chromatid exchange, SCE ）頻率。
一、原理
5- 溴脫氧尿嘧啶核苷（ 5-Bromodeoxy-urdine, BrdU ）在 DNA 的復制過程中，摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶（ thymidine, T ）的位置。根據 DNA 的半保留復制規(guī)律，哺乳動物或人的細胞在 BrdU 的培養(yǎng)液中經歷了兩個周期后，它的兩條姊妹染色單體的 DNA 雙鏈在化學組成上有了差別。
當染色體的 DNA 鏈的兩條多核苷酸鏈都被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示淺色，如果染色體的 DNA 鏈中僅有一條多核苷酸鏈被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示深色。應用姊妹染色單體區(qū)分染色法（ SCD ）研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換，稱為姊妹染色單體互換。
二、用品和試劑
45 ℃水浴，紫外線燈（ 20W ）。余同外周血染色體制備。
試劑： BrdU 溶液：用無菌青霉素瓶，在普通條件下稱取 BrdU 2mg ，然后在無菌室內加入無菌生理鹽水 4ml ，用黑紙避光， 4 ℃冰箱保存，新鮮配置。 1 × SSC 溶液： 0.15mol/L NaCl ， 0.015mol/L 檸檬酸鈉。
三、操作步驟
l ．細胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人外周血淋巴細胞， 24h 后，加入 BrdU 使其終濃度為 20 μ g/ml 。
2 ．繼續(xù)避光培養(yǎng) 48 小時，終止培養(yǎng)前 2 — 3 小時加秋水仙堿。
3 ．培養(yǎng)結束收獲細胞，常規(guī)制備染色體，操作同實驗一。
4 ．染色體制片在 37 ℃恒溫箱內老化 24 小時或室溫放置 1 — 2 天。
5 ．將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫（ 45 ℃）水浴鍋上，在玻片上滴加已預熱至 45 ℃的 1 × SSC 溶液。
6 ．將紫外燈放在恒溫水浴上，燈與標本垂直，其外加蓋報紙數張以阻擋紫外線。照射距離為 6cm ，時間 15min 。
7 ．照射完畢后以蒸餾水洗去 1 × SSC 。
8 ． 1 ∶ 10 Giemsa 染色 5 分鐘。
9 ．自來水細流沖洗去多余染料，干燥，鏡檢。
10 ．計數 SCE 。選擇染色體分散較好，數目為 46 的中期分裂相 20 個進行觀察計數，凡在染色單體端部出現的互換計為一次 SCE ，在染色單體中間出現的互換計為兩次 SCE 。凡在著絲粒部位發(fā)生一次互換，判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發(fā)生的扭轉，計為一次 SCE ，但另列入“著絲粒區(qū)互換（ CME ）”一項。
1974 年 KO Renberg 和 Froeed-Lender 改進了這一技術，建立了較簡易的 BrdU-Giemsa 技術。這種技術用于研究細胞周期、染色體半保留復制、染色體的分子結構和畸變，以及 DNA 的復制、損傷與修復等一系列重要理論問題，還可以用于分析姊妹染色單體互換（ Sister chromatid exchange, SCE ）頻率。
由于 SCE 能靈敏地檢測染色體的變化，表現出劑量 - 效應關系。因此，目前已把 SCE 列為檢測致突變物、致癌物地常規(guī)指標之一。
一、原理
5- 溴脫氧尿嘧啶核苷（ 5-Bromodeoxy-urdine, BrdU ）在 DNA 的復制過程中，摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶（ thymidine, T ）的位置。根據 DNA 的半保留復制規(guī)律，哺乳動物或人的細胞在 BrdU 的培養(yǎng)液中經歷了兩個周期后，它的兩條姊妹染色單體的 DNA 雙鏈在化學組成上有了差別。
當染色體的 DNA 鏈的兩條多核苷酸鏈都被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示淺色，如果染色體的 DNA 鏈中僅有一條多核苷酸鏈被 BrdU 所替換， Giemsa 染色顯示深色。應用姊妹染色單體區(qū)分染色法（ SCD ）研究來自一個染色體的兩條單體之間在同一個位點發(fā)生同源片段的交換，稱為姊妹染色單體互換。
二、用品和試劑
45 ℃水浴，紫外線燈（ 20W ）。余同外周血染色體制備。
試劑： BrdU 溶液：用無菌青霉素瓶，在普通條件下稱取 BrdU 2mg ，然后在無菌室內加入無菌生理鹽水 4ml ，用黑紙避光， 4 ℃冰箱保存，新鮮配置。 1 × SSC 溶液： 0.15mol/L NaCl ， 0.015mol/L 檸檬酸鈉。
三、操作步驟
l ．細胞培養(yǎng)：常規(guī)培養(yǎng)人外周血淋巴細胞， 24h 后，加入 BrdU 使其終濃度為 20 μ g/ml 。
2 ．繼續(xù)避光培養(yǎng) 48 小時，終止培養(yǎng)前 2 — 3 小時加秋水仙堿。
3 ．培養(yǎng)結束收獲細胞，常規(guī)制備染色體，操作同實驗一。
4 ．染色體制片在 37 ℃恒溫箱內老化 24 小時或室溫放置 1 — 2 天。
5 ．將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫（ 45 ℃）水浴鍋上，在玻片上滴加已預熱至 45 ℃的 1 × SSC 溶液。
6 ．將紫外燈放在恒溫水浴上，燈與標本垂直，其外加蓋報紙數張以阻擋紫外線。照射距離為 6cm ，時間 15min 。
7 ．照射完畢后以蒸餾水洗去 1 × SSC 。
8 ． 1 ∶ 10 Giemsa 染色 5 分鐘。
9 ．自來水細流沖洗去多余染料，干燥，鏡檢。
10 ．計數 SCE 。選擇染色體分散較好，數目為 46 的中期分裂相 20 個進行觀察計數，凡在染色單體端部出現的互換計為一次 SCE ，在染色單體中間出現的互換計為兩次 SCE 。凡在著絲粒部位發(fā)生一次互換，判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發(fā)生的扭轉，計為一次 SCE ，但另列入“著絲粒區(qū)互換（ CME ）”一項。
