實(shí)驗(yàn)原理

將細(xì)胞小室（Transwell小室）放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。

細(xì)胞小室（transwell）

應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。當(dāng)然不同細(xì)胞其體積不同，具體選擇時(shí)要考慮到細(xì)胞大小。

所應(yīng)有的常見實(shí)驗(yàn)

共培養(yǎng)體系：

小于3.0?m孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，因此，若研究不涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，不需要細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0?m以下孔徑。常用0.4、3.0?m。我們實(shí)驗(yàn)室用的是0.4?m。

將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。

趨化性實(shí)驗(yàn)

可用5.0、8.0、12.0?m膜，上室細(xì)胞可穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力。

①細(xì)胞B對(duì)細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的趨化作用。

②趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用。

腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

常用8.0、12.0?m膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

常用8.0、12.0?m膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類似。

上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過(guò)聚碳酸酯膜。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

侵襲實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)用品

細(xì)胞小室：

有很多不同規(guī)格，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自己選擇。

上層培養(yǎng)液：

上層培養(yǎng)液采用無(wú)血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。

細(xì)胞：

值得注意的是，有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。建議實(shí)驗(yàn)前先用酶譜法檢測(cè)MMPs的表達(dá)，特別是MMP-2的表達(dá)。如果不清楚細(xì)胞MMPs的表達(dá)情況，就盲目進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，一次Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。

另外，為了讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果geng明顯，可先撤血清讓細(xì)胞饑餓12－24h，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

基質(zhì)膠：

常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，

如果購(gòu)買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么Matrigel就不需要購(gòu)買了。

下層培養(yǎng)液：

下層常用含5%－10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個(gè)人認(rèn)為，F(xiàn)BS仍是zui合適的。

細(xì)胞培養(yǎng)板：

常用于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔zui常用。細(xì)胞培養(yǎng)板沒(méi)什么特殊要求，普通的細(xì)胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買的Transwell小室相配套。

24孔細(xì)胞小室

12孔細(xì)胞小室

6孔細(xì)胞小室

此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白，這樣做的目的是使穿過(guò)膜的細(xì)胞geng好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。細(xì)胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。如果培養(yǎng)時(shí)間很長(zhǎng)（>24h），細(xì)胞還是會(huì)掉到下室里面去，所以有條件的話，zui好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。

實(shí)驗(yàn)步驟

無(wú)基質(zhì)膠Transwell小室制備

① 包被基底膜：

用50mg/L Matrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。

② 水化基底膜：

吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，30min。

另有方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9?g/?l) 60-80?l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為zui好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。

制備細(xì)胞懸液

① 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

② 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10×105，個(gè)人認(rèn)為不要超過(guò)5×105。

具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過(guò)多，穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快，如果zui后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過(guò)少的話，可能還沒(méi)到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過(guò)，因此zui少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。

對(duì)照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對(duì)細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。

接種細(xì)胞

①取細(xì)胞懸液100－200?l加入小室，不同公司的、不同大小的小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，請(qǐng)參考說(shuō)明書。24孔板小室一般200?l。

② 24孔板下室一般加入500?l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說(shuō)明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。

③ 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。

另外，我看到細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過(guò)會(huì)聚集成團(tuán)，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現(xiàn)象。

在培養(yǎng)過(guò)程中，膜下會(huì)逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過(guò)培養(yǎng)一段時(shí)間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時(shí)發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴(yán)重。因此，個(gè)人建議，zui好接種細(xì)胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來(lái)看看，確信沒(méi)有大氣泡產(chǎn)生。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)

檢測(cè)穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：

直接計(jì)數(shù)法

1、“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)

這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。可以通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞

① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞；

② 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺(tái)靡藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。

③ 細(xì)胞計(jì)數(shù)：使用正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Transwell小室反過(guò)來(lái)底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長(zhǎng)期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點(diǎn)浪費(fèi)。

取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。一般采用3-5個(gè)視野，也有人用10個(gè)，都是隨機(jī)選取。

間接計(jì)數(shù)法

由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過(guò)膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。

間接計(jì)數(shù)法主要用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多，而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。

1、MTT法

① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞；

② 24孔板中加入500?l含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，37℃ 4h后取出。

③ 24孔板中加入500?l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在DMSO中，振蕩10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上測(cè)OD值。

2、熒光試劑檢測(cè)

這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細(xì)胞，再將細(xì)胞裂解，檢測(cè)熒光值。

3、結(jié)晶紫檢測(cè)

原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是染色和脫色的過(guò)程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色