革蘭氏染色是一項經典的細菌鑒別手段，自19世紀80年代丹麥的醫師GRAM創立起，至今已經近一個半世紀，仍舊在細菌的檢測和鑒定分類上被廣泛應用著。在我國，GB 4789系列的國標中很多致病菌的檢測也都需要進行革蘭氏染色，可見其重要性。甚至可以說沒有精-準掌握革蘭氏染色的微生物檢驗員，不會是一個合格的檢驗員。

革蘭氏染色的原理：

細菌細胞通過結晶紫初染和dian液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與dian的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與dian復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與dian復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

涂片、晾干、固定、染色、水洗、媒染、脫色、復染。此處不加贅述。

影響革蘭氏染色結果準確性的關鍵因素：

1、試劑影響

這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗成功zui基礎的一環。

2、染色菌的選擇

菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我們染色過程中選擇的菌應該是處于活躍生長期，這樣的細菌活性強，生理特征明顯，所以染色的結果準確度高，一般情況下不會出現誤差。培養時間較長的革蘭氏陽性菌，由于細胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經死亡或者自行溶解了，造成細胞壁通透性增加，就會呈現出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經統計過培養至不同時間的金葡的革蘭氏染色結果，結果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結果的準確率基本可以達到，而超過26h之后，準確率就開始下降，培養至36h時，準確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處于活躍期、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴格的在國標要求的時間段內進行染色試驗，不能提前或者延后。

3、涂菌的狀態

在染色zui初的涂布中，在挑取菌體后應該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極-大影響染色結果的準確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產生假陽性的結果。同時，在初染、媒染及復染的過程中，應將染液覆蓋整個菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達到zui-佳效果。

4、媒染時間

媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由于媒染時間過長，結晶紫在dian液長時間作用下過分牢固結合在菌體細胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控制在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到，而超過60s準確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控制在50-60s為宜。

5、酒精脫色

酒精脫色也是一個對結果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌zui主要的差異是細胞壁肽聚糖層厚度和結構，革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時，細菌細胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細胞壁的通透性，結晶紫及dian復合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復染呈紅色；而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進入，這樣結晶紫和復合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因此，酒精脫色時間短，脫色效果不佳，會導致陰性菌菌體內的結晶紫和復合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現明顯的誤差，使陰性菌出現假陽性。而洗脫時間過長，也會導致陽性菌的細胞壁被酒精破壞，導致細胞內的紫色被洗脫，呈現假陰性。因此洗脫時間也是革蘭氏染色的關鍵環節。洗脫時間應當嚴格控制在20s-30s之間，同時保證洗脫效果。

總結一下，在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴格控制的幾個方面：染色菌必須是在其活躍期內，涂布狀態不可太厚，媒染時間嚴格控制在50s-60s之間，脫色時間嚴格控制在20s-30s。把握以上的關鍵控制點，革蘭氏染色基本就不會出現問題