幾種常見的微生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)
本文介紹幾種常見的微生物基礎(chǔ)試驗(yàn)的目的、原理、內(nèi)容等,以便剛剛接觸微生物的同-志們對試驗(yàn)有個(gè)基本的認(rèn)識.
實(shí)驗(yàn)一 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟;掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法;
2、了解培養(yǎng)基的配制原理;了解常見滅菌、清毒基本原理及方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物.培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素和水.根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法.
牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用zui廣泛和zui普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基.由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的zui基本的營養(yǎng)物質(zhì),所以可供微生物生長繁殖之用.
干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果.
三、試劑與器材
1、器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等.
2、試劑 牛-肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查
2、干熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫?fù)u床→降溫→開箱取物
3、高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4、過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、要嚴(yán)格按配方配制.
2、調(diào)pH不要過頭.
3、干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊,注意溫度的時(shí)間控制,70oC以下放物、取物.
4、高壓滅菌要注意物品不要過多,加熱后排除冷空氣,到時(shí)降壓回零取物.
5、過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時(shí),壓力要適當(dāng),不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存.
實(shí)驗(yàn)二 土壤中微生物分離純化培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù);掌握微生物培養(yǎng)方法;
2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長特征;進(jìn)一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù).
二、實(shí)驗(yàn)原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化.
常用的分離、純化方法:單細(xì)胞挑取法,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法.
稀釋涂布平板法步驟:倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養(yǎng)－挑菌落.
平板劃線法步驟:倒平板－標(biāo)記培養(yǎng)基名稱－劃線.
三、試劑與器材
1、器材 盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等.
2、試劑 牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,高氏1號培養(yǎng)基,查氏培養(yǎng)基
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、土壤稀釋液的制備
2、微生物分離純化:稀釋涂平板法,平皿劃線分離法,微生物培養(yǎng)技術(shù)
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、掌握含菌培養(yǎng)基的配制,嚴(yán)格控制溫度.
2、平板劃線應(yīng)防止染菌,同時(shí)應(yīng)注意劃線深度及密度.
實(shí)驗(yàn)三 菌種保藏
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、學(xué)習(xí)并掌握菌種保藏的基本原理.
2、掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
微生物個(gè)體微小、代謝旺盛、生長繁殖快,如果保存不妥容易發(fā)生變異和雜菌污染,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡等現(xiàn)象.因此,保存好菌種是非常必要和重要的.常用的菌種保藏方法包括傳代培養(yǎng)法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法
三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌、青霉菌、放線菌
2、試劑 液體石蠟、甘油、五氧化2磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰
3、器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養(yǎng)皿;安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超-低溫冰箱和液氮罐等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、斜面保藏法
2、液體石蠟法
3、穿刺保藏法
4、砂土管保藏法
5、冷凍真空干燥保存法
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、清楚各種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn),針對不同要求選擇適宜的保藏方法.
2、熔封安瓶時(shí)防止封閉不嚴(yán).
3、液氮凍存操作應(yīng)防止凍傷.
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解簡單染色法的原理,并掌握其操作方法.
2、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù).
3、鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法.
4、初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌個(gè)體微小,且較透明,必須借助染色法使菌體著色,與背景形成鮮明的對比,以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等.簡單染色法是zui基本的染色方法,是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色.此法操作簡便,適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察.常用堿性染料進(jìn)行簡單染色.
三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌,枯草芽孢桿菌
2、試劑 呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)、齊氏石炭-酸復(fù)紅染液.
3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲-苯)等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
簡單染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、水洗步驟水流不宜過大,過急,以免涂片薄膜脫落.
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解放線菌、霉菌形態(tài)觀察的原理;
2、學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法;
3、初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細(xì)菌.常見放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲(簡稱“基絲”),基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱“氣絲”),并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子.有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無氣絲.在顯微鏡下直接觀察時(shí),氣絲在上層、基絲在下層,氣絲色暗,基絲較透明.孢子絲依種類的不同,有直、波曲、各種螺旋形或輪生.
霉菌可產(chǎn)生復(fù)合分枝的菌絲體,分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子.霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲) 及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù).霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多,常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍,因此,用低倍顯微鏡即可觀察.人們設(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法,這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征.本實(shí)驗(yàn)采用插片法.
插片法:將放線菌接種在瓊脂平板上,插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng),使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上.觀察時(shí),輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上直接鏡檢.這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征,而且便于觀察不同生長期的形態(tài).
三、試劑與器材
1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,細(xì)黃鏈霉菌或青色鏈霉菌,滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養(yǎng)基.
2、實(shí)驗(yàn)器材 經(jīng)滅菌的:平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃涂棒,以及載玻片、接種環(huán)、接種鏟、鑷子、顯微鏡等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
倒平板→接種→插片→培養(yǎng)→鏡檢
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、倒平板要厚一些,接種時(shí)劃線要密.
2、插片時(shí)要有一定角度并與劃線垂直.
3、觀察時(shí),宜用略暗光線;先用低倍鏡找到適當(dāng)視野,geng換高倍鏡觀察.
4、如果用0、1%美藍(lán)對培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察,效果會(huì)geng好.
實(shí)驗(yàn)六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;
2、了解革蘭氏染色法在細(xì)菌分類鑒定中的重要性;
3、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù);
4、學(xué)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用方法;
5、初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色,再用dian液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,zui后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染.經(jīng)此方法染色后,細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌;如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌重要的鑒別特征,為保證染色結(jié)果的正確性,采用規(guī)范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石炭-酸復(fù)紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi),進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色,而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫,當(dāng)用對比度大的復(fù)染劑染色后,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色,使芽孢和菌體geng易于區(qū)分.
三、試劑與器材
1、材料:枯草芽孢桿菌12～18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,大腸桿菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物
2、試劑 革蘭氏染色液(結(jié)晶紫液、dian液、95％乙醇、番紅液).5％孔雀綠水溶液
3、實(shí)驗(yàn)器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲-苯)、擦鏡紙、生理鹽水等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、革蘭氏染色法 制片→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢.
2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→復(fù)染→水洗→鏡檢.
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié),嚴(yán)格掌握脫色時(shí)間.
實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生-殖方式,并掌握酵母菌與細(xì)菌形態(tài)特征的區(qū)別.
2、學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物,菌體比細(xì)菌大而且不運(yùn)動(dòng).酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種,以無性繁殖為主.芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式,少數(shù)為裂殖;有性繁殖是產(chǎn)生子囊和子囊孢子.本實(shí)驗(yàn)是通過美藍(lán)染液水浸片和水一dian液水浸片來觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式.
美藍(lán)是一種無-毒性的染料,它的氧化型呈藍(lán)色,還原型無色.用美藍(lán)對酵母活細(xì)胞染色時(shí),由于細(xì)胞的新陳代謝作用,細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型,而對代謝作用微弱或死細(xì)胞,無此還原能力或還原能力極弱,而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色.因此,不僅用此法可觀察酵母細(xì)胞形態(tài),也可用來鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞.
三、試劑與器材
1、材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養(yǎng)2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養(yǎng)物.
2、試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍(lán)染色液、革蘭氏染色用的dian液.
3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、美藍(lán)浸片觀察 酵母培養(yǎng)→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢
2、水-dian浸片觀察
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、染液不宜過多或過少,否則,在蓋上蓋玻片時(shí),菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡.
2、用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側(cè)與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產(chǎn)生
實(shí)驗(yàn)一 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟;掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法;
2、了解培養(yǎng)基的配制原理;了解常見滅菌、清毒基本原理及方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物.培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素和水.根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法.
牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用zui廣泛和zui普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基.由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的zui基本的營養(yǎng)物質(zhì),所以可供微生物生長繁殖之用.
干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果.
三、試劑與器材
1、器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等.
2、試劑 牛-肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查
2、干熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫?fù)u床→降溫→開箱取物
3、高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4、過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、要嚴(yán)格按配方配制.
2、調(diào)pH不要過頭.
3、干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊,注意溫度的時(shí)間控制,70oC以下放物、取物.
4、高壓滅菌要注意物品不要過多,加熱后排除冷空氣,到時(shí)降壓回零取物.
5、過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時(shí),壓力要適當(dāng),不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存.
實(shí)驗(yàn)二 土壤中微生物分離純化培養(yǎng)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù);掌握微生物培養(yǎng)方法;
2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長特征;進(jìn)一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù).
二、實(shí)驗(yàn)原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化.
常用的分離、純化方法:單細(xì)胞挑取法,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法.
稀釋涂布平板法步驟:倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養(yǎng)－挑菌落.
平板劃線法步驟:倒平板－標(biāo)記培養(yǎng)基名稱－劃線.
三、試劑與器材
1、器材 盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等.
2、試劑 牛-肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,高氏1號培養(yǎng)基,查氏培養(yǎng)基
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、土壤稀釋液的制備
2、微生物分離純化:稀釋涂平板法,平皿劃線分離法,微生物培養(yǎng)技術(shù)
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、掌握含菌培養(yǎng)基的配制,嚴(yán)格控制溫度.
2、平板劃線應(yīng)防止染菌,同時(shí)應(yīng)注意劃線深度及密度.
實(shí)驗(yàn)三 菌種保藏
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、學(xué)習(xí)并掌握菌種保藏的基本原理.
2、掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
微生物個(gè)體微小、代謝旺盛、生長繁殖快,如果保存不妥容易發(fā)生變異和雜菌污染,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡等現(xiàn)象.因此,保存好菌種是非常必要和重要的.常用的菌種保藏方法包括傳代培養(yǎng)法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法
三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌、青霉菌、放線菌
2、試劑 液體石蠟、甘油、五氧化2磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰
3、器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養(yǎng)皿;安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超-低溫冰箱和液氮罐等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、斜面保藏法
2、液體石蠟法
3、穿刺保藏法
4、砂土管保藏法
5、冷凍真空干燥保存法
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、清楚各種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn),針對不同要求選擇適宜的保藏方法.
2、熔封安瓶時(shí)防止封閉不嚴(yán).
3、液氮凍存操作應(yīng)防止凍傷.
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解簡單染色法的原理,并掌握其操作方法.
2、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù).
3、鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法.
4、初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌個(gè)體微小,且較透明,必須借助染色法使菌體著色,與背景形成鮮明的對比,以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等.簡單染色法是zui基本的染色方法,是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色.此法操作簡便,適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察.常用堿性染料進(jìn)行簡單染色.
三、試劑與器材
1、材料 大腸桿菌,枯草芽孢桿菌
2、試劑 呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)、齊氏石炭-酸復(fù)紅染液.
3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲-苯)等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
簡單染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、水洗步驟水流不宜過大,過急,以免涂片薄膜脫落.
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解放線菌、霉菌形態(tài)觀察的原理;
2、學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法;
3、初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細(xì)菌.常見放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲(簡稱“基絲”),基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱“氣絲”),并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子.有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無氣絲.在顯微鏡下直接觀察時(shí),氣絲在上層、基絲在下層,氣絲色暗,基絲較透明.孢子絲依種類的不同,有直、波曲、各種螺旋形或輪生.
霉菌可產(chǎn)生復(fù)合分枝的菌絲體,分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子.霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲) 及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù).霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多,常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍,因此,用低倍顯微鏡即可觀察.人們設(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法,這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征.本實(shí)驗(yàn)采用插片法.
插片法:將放線菌接種在瓊脂平板上,插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng),使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上.觀察時(shí),輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上直接鏡檢.這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征,而且便于觀察不同生長期的形態(tài).
三、試劑與器材
1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,細(xì)黃鏈霉菌或青色鏈霉菌,滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養(yǎng)基.
2、實(shí)驗(yàn)器材 經(jīng)滅菌的:平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃涂棒,以及載玻片、接種環(huán)、接種鏟、鑷子、顯微鏡等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
倒平板→接種→插片→培養(yǎng)→鏡檢
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、倒平板要厚一些,接種時(shí)劃線要密.
2、插片時(shí)要有一定角度并與劃線垂直.
3、觀察時(shí),宜用略暗光線;先用低倍鏡找到適當(dāng)視野,geng換高倍鏡觀察.
4、如果用0、1%美藍(lán)對培養(yǎng)后的蓋玻片進(jìn)行染色后觀察,效果會(huì)geng好.
實(shí)驗(yàn)六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;
2、了解革蘭氏染色法在細(xì)菌分類鑒定中的重要性;
3、學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù);
4、學(xué)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用方法;
5、初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征.
二、實(shí)驗(yàn)原理
革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行染色,再用dian液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,zui后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染.經(jīng)此方法染色后,細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌;如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌重要的鑒別特征,為保證染色結(jié)果的正確性,采用規(guī)范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石炭-酸復(fù)紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi),進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色,而芽孢一經(jīng)著色難以被水洗脫,當(dāng)用對比度大的復(fù)染劑染色后,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑的顏色,使芽孢和菌體geng易于區(qū)分.
三、試劑與器材
1、材料:枯草芽孢桿菌12～18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,大腸桿菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物
2、試劑 革蘭氏染色液(結(jié)晶紫液、dian液、95％乙醇、番紅液).5％孔雀綠水溶液
3、實(shí)驗(yàn)器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲-苯)、擦鏡紙、生理鹽水等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、革蘭氏染色法 制片→初染→媒染→脫色→復(fù)染→鏡檢.
2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→復(fù)染→水洗→鏡檢.
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、涂片時(shí),生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應(yīng)盡可能均勻,
2、乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié),嚴(yán)格掌握脫色時(shí)間.
實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒定
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生-殖方式,并掌握酵母菌與細(xì)菌形態(tài)特征的區(qū)別.
2、學(xué)習(xí)鑒別死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法.
二、實(shí)驗(yàn)原理
酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物,菌體比細(xì)菌大而且不運(yùn)動(dòng).酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種,以無性繁殖為主.芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式,少數(shù)為裂殖;有性繁殖是產(chǎn)生子囊和子囊孢子.本實(shí)驗(yàn)是通過美藍(lán)染液水浸片和水一dian液水浸片來觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式.
美藍(lán)是一種無-毒性的染料,它的氧化型呈藍(lán)色,還原型無色.用美藍(lán)對酵母活細(xì)胞染色時(shí),由于細(xì)胞的新陳代謝作用,細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型,而對代謝作用微弱或死細(xì)胞,無此還原能力或還原能力極弱,而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色.因此,不僅用此法可觀察酵母細(xì)胞形態(tài),也可用來鑒別酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞.
三、試劑與器材
1、材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養(yǎng)2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養(yǎng)物.
2、試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍(lán)染色液、革蘭氏染色用的dian液.
3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等.
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、美藍(lán)浸片觀察 酵母培養(yǎng)→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢
2、水-dian浸片觀察
五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)
1、染液不宜過多或過少,否則,在蓋上蓋玻片時(shí),菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡.
2、用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側(cè)與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產(chǎn)生
