免疫熒光技術你真的會嗎？
一、直接免疫熒光法
（一）基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
（二）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（三）實驗步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。
2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間（參考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
（四）注意事項
1. 對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。
2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數(shù)小時，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效-果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
（1） 標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2） 特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。
（3） 陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。
如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
4. 一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本蕞好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
二、間接免疫熒光法測抗體
（一）基本原理
染色程序分為兩步，第1步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第1步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。
（二）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋 。
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（三）實驗步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩 。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
6. 重復操作3。
7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。
（四）注意事項
1. 熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2. 每次試驗時 ，需設置以下三種對照：
（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物
（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物
（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色
（一）基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
（二）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（三）實驗步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。
2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間（參考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
（四）注意事項
1. 對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。
2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數(shù)小時，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效-果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
（1） 標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2） 特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。
（3） 陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。
如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
4. 一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本蕞好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
二、間接免疫熒光法測抗體
（一）基本原理
染色程序分為兩步，第1步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第1步發(fā)生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。
（二）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋 。
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（三）實驗步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩 。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
6. 重復操作3。
7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。
（四）注意事項
1. 熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2. 每次試驗時 ，需設置以下三種對照：
（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標記物
（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標記物
（3） 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色
