免疫熒光染色：

(1）冰凍切片用0. 01 moUL PBST（或PBS）漂洗或沖洗3次，每次5min。

(2) 3% H2O2孵育10min，再用0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。

(3) 5％一8％的正常動(dòng)物血清（山羊或馬血清）孵育30-60min。

(4）洗掉血清，滴加一抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃過(guò)夜。

(5）吸出一抗，0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min，加入熒光標(biāo)記的二抗（0. 01 mol/L PBS配制），4℃過(guò)夜。

(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次 10min。

(7）封片劑封片，熒光顯微鏡觀察照相。

注意事項(xiàng)：

(1) 由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個(gè)小時(shí)，因此，熒光二抗應(yīng)避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應(yīng)盡早照相，目前有市售的熒光增強(qiáng)劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。

(2) 常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP；紅色熒光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed；藍(lán)色熒光：Hoechst、DAPI；黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

(3）不同的熒光素激發(fā)的波長(zhǎng)不同，因此，選用濾光片時(shí)要注意。一般紫外線的激發(fā)波長(zhǎng)為334-365nm，藍(lán)光的激發(fā)波長(zhǎng)為435-490nm，綠光的激發(fā)波長(zhǎng)為546nm左右。

(4) 熒光顯微鏡應(yīng)提前至少15 min打開汞燈預(yù)熱。關(guān)閉30min后方可再開啟。

(5）免疫熒光的組織要求很高，載玻片及蓋玻片要干凈無(wú)雜質(zhì)。進(jìn)行熒光染色時(shí)，需注意染液的pH、濃度和染色溫度，還要避免對(duì)熒光有熄滅作用的物質(zhì)的接觸。組織和細(xì)胞也有自發(fā)熒光，如紅細(xì)胞中的血紅蛋白呈紅色熒光，維生素A呈綠色自發(fā)性熒光等