兩大蛋白質染色主流方法大比較
常用的蛋白質染色試劑分為已考馬斯亮藍為代表的有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍染色法的應用較為廣泛，現將其與其他的蛋白質染色方法(主要是銀染法)作一比較，幫助大家geng好地去選擇合適的蛋白質染色方法。
蛋白質的染色常用的有4類：有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。
其中有機試劑染色以考馬斯亮藍染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)為代表，在蛋白質分析中常用，但對低豐度蛋白質的顯現較差;銀染靈敏度雖高，卻常與質譜不兼容;熒光染色以SYPRO試劑為主。
蛋白質檢測靈敏度高，能兼容質譜，但由于需要配備特殊的檢測儀器及試劑的昂貴，未被作為常規方法使用;而同位素顯色則存在安全性和操作局限性等問題。因此，篩選簡便、節約、檢測靈敏度高、質譜兼容的蛋白質著色法是蛋白質組 研究所需。
由于考馬斯亮藍染色法的廣泛運用，近年來就考馬斯亮藍染色法在提高其靈敏性方面研究者們作了許多改進，方法眾多，評價不一。
我們在作雙向凝膠電泳 時，將常用的幾種考馬斯亮藍染色法及銀染進行了比較，并就其染色影響因素作出分析。
細胞總蛋白質的提取
取4份經常規培養的急性早幼粒白血病細胞株(NB4)1×107細胞各重懸于350 μl蛋白質裂解緩沖液中(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚蘭)，置冰浴中超聲裂解，靜置30分鐘，15500×g離心30分鐘，取上清，進行蛋白質定量。
單向定量電泳
取蛋白質分子量標準物，第1次按1∶2稀釋后，以后按1∶3倍比例逐級稀釋，經4級稀釋后，取15μl上樣液上樣，β-半乳糖苷酶上樣量依次分別為1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯-酰胺凝膠單向電泳，同時電泳4份膠，顯色以確定染色靈敏度。
雙向電泳
取 300μl樣品液沿水化盤中槽的邊緣自左向右線性加入，將17cm IPG膠條膠面朝下置于槽中，靜置45分鐘后覆蓋礦物油，在20℃溶脹11～16小時。溶脹后的膠條置于等電聚焦盤中，在Protean IEF Cell中進行等電聚焦，溫度設置為20℃，電壓模式設置為：快速升壓，250 V，0.5小時;500 V，0.5小時;10000 V，60000 Vh(伏特×小時)。
取IEF后的IPG 膠條，先后分別置于含DTT平衡液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)及含碘yi酰胺平衡液2(同平衡液1，但其中DTT換為2.5g/L 碘yi酰胺)中輕微搖蕩各10分鐘。將平衡好的IPG 膠條置于預先灌制的12g/L SDS-聚丙烯-酰胺凝膠上，封固，在15℃低溫水循環條件下，15 mA/gel電泳15分鐘，然后以25mA/gel恒流電泳。
顯色
取出SDS-聚丙烯-酰胺凝膠，經超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進行。4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統考馬斯亮藍染色法：清洗后的凝膠經固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小時，隨后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)著色過夜，再經洗脫液(5%甲醇、7.5%乙酸)過夜脫色至背景清晰。
②膠體考馬斯亮藍染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝膠先經超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇)著色過夜，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。
③改良考馬斯亮藍染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍染色法，只是染色液組成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，著色1小時即可。
④銀染(silver staining)：凝膠漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小時，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。
成像、分析、質譜鑒定
脫色后，凝膠經GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進行分析。切取蛋白質點，胰酶消化，行質譜鑒定。
結果
4種染色法的蛋白質檢測靈敏性分析
β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。
經傳統考馬斯亮藍染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍染色法的效果geng好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度蕞高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現，同時在4ng可見隱約條帶。
4種染色法的比較顯示，靈敏度蕞高的是銀染法，可達納克級水平，其次為改良考馬斯亮藍染色法，10納克級蛋白質能被檢測。而膠體考馬斯亮藍染色法和經典考馬斯亮藍染色法稍差，檢測水平僅達幾十納克。
4種染色法的雙向電泳蛋白質點顯示比較
來自NB4細胞的全蛋白經pH 3-10NL的等電點梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現蕞少，膠體考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現較多，而改良考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現geng多。
凝膠背景以后二者為geng清晰。經PDQuest軟件進行分析，3幅圖的蛋白質點顯現數分別為483、679、890。NB4細胞的全蛋白經pH 5-8 IPG分離，分別經改良考馬斯亮藍染色法與銀染法著色成像的蛋白點顯示，二者上樣量一致，蛋白點的顯現數量相當，但銀染的蛋白點明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。
4種染色法的可操作性比較
在比較其蛋白質檢測靈敏性的同時，對染色法的操作簡便性、安全性以及蛋白質經質譜鑒定的成功率也作了對比。比較顯示，考馬斯亮藍染方法簡便，但耗時較長，經改進后可以做到無-毒操作，質譜兼容性較高。
銀染步驟繁多，但耗時短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻報道為質譜兼容的，但仍然表現為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍染
蛋白質的染色常用的有4類：有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色。
其中有機試劑染色以考馬斯亮藍染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)為代表，在蛋白質分析中常用，但對低豐度蛋白質的顯現較差;銀染靈敏度雖高，卻常與質譜不兼容;熒光染色以SYPRO試劑為主。
蛋白質檢測靈敏度高，能兼容質譜，但由于需要配備特殊的檢測儀器及試劑的昂貴，未被作為常規方法使用;而同位素顯色則存在安全性和操作局限性等問題。因此，篩選簡便、節約、檢測靈敏度高、質譜兼容的蛋白質著色法是蛋白質組 研究所需。
由于考馬斯亮藍染色法的廣泛運用，近年來就考馬斯亮藍染色法在提高其靈敏性方面研究者們作了許多改進，方法眾多，評價不一。
我們在作雙向凝膠電泳 時，將常用的幾種考馬斯亮藍染色法及銀染進行了比較，并就其染色影響因素作出分析。
細胞總蛋白質的提取
取4份經常規培養的急性早幼粒白血病細胞株(NB4)1×107細胞各重懸于350 μl蛋白質裂解緩沖液中(8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚蘭)，置冰浴中超聲裂解，靜置30分鐘，15500×g離心30分鐘，取上清，進行蛋白質定量。
單向定量電泳
取蛋白質分子量標準物，第1次按1∶2稀釋后，以后按1∶3倍比例逐級稀釋，經4級稀釋后，取15μl上樣液上樣，β-半乳糖苷酶上樣量依次分別為1μg、 0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。作12g/L SDS-聚丙烯-酰胺凝膠單向電泳，同時電泳4份膠，顯色以確定染色靈敏度。
雙向電泳
取 300μl樣品液沿水化盤中槽的邊緣自左向右線性加入，將17cm IPG膠條膠面朝下置于槽中，靜置45分鐘后覆蓋礦物油，在20℃溶脹11～16小時。溶脹后的膠條置于等電聚焦盤中，在Protean IEF Cell中進行等電聚焦，溫度設置為20℃，電壓模式設置為：快速升壓，250 V，0.5小時;500 V，0.5小時;10000 V，60000 Vh(伏特×小時)。
取IEF后的IPG 膠條，先后分別置于含DTT平衡液1(6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L)及含碘yi酰胺平衡液2(同平衡液1，但其中DTT換為2.5g/L 碘yi酰胺)中輕微搖蕩各10分鐘。將平衡好的IPG 膠條置于預先灌制的12g/L SDS-聚丙烯-酰胺凝膠上，封固，在15℃低溫水循環條件下，15 mA/gel電泳15分鐘，然后以25mA/gel恒流電泳。
顯色
取出SDS-聚丙烯-酰胺凝膠，經超純水清洗2次，每次1分鐘，4塊膠分別按4種不同的染色方法顯色。下列每步操作皆在搖床上進行。4種染色法成份組成及操作如下： ①傳統考馬斯亮藍染色法：清洗后的凝膠經固定液(45.4%甲醇、4.6%乙酸)固定1小時，隨后用染色液(45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250)著色過夜，再經洗脫液(5%甲醇、7.5%乙酸)過夜脫色至背景清晰。
②膠體考馬斯亮藍染色法(colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB)染色法：凝膠先經超純水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液(1.6%磷酸、8%硫酸銨、0.02% CBB G250、20%乙醇)著色過夜，洗脫液為超純水，換液3～4次直至背景清晰。
③改良考馬斯亮藍染色法(modified Coomassie brilliant blue，mCBB)染色法[6];操作方法同膠體考馬斯亮藍染色法，只是染色液組成不同(0.12% CBB G250、10%硫酸銨、10%磷酸、20%乙醇)，著色1小時即可。
④銀染(silver staining)：凝膠漂洗后先被固定液(50%甲醇+ 5%乙酸)固定1小時，隨后分別用50%甲醇和超純水清洗各10分鐘，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分鐘，超純水清洗2次，每次1分鐘，再用預冷的0.15% AgNO3著色20分鐘，超純水再次清洗2次，每次1分鐘，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛顯色20～30秒，當溶液變黃以后除去，換新鮮的溶液后繼續顯色直至顯色適度后，以5%乙酸終止顯色。
成像、分析、質譜鑒定
脫色后，凝膠經GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，用PDQuest軟件進行分析。切取蛋白質點，胰酶消化，行質譜鑒定。
結果
4種染色法的蛋白質檢測靈敏性分析
β-半乳糖苷酶的上樣量依次分別為1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。
經傳統考馬斯亮藍染色后的條帶在62ng水平隱隱可見;而膠體考馬斯亮藍染色法的靈敏度稍高，62ng條帶明顯可見;改良考馬斯亮藍染色法的效果geng好些，在15.6ng水平可見條帶的顯示;而銀染法靈敏度蕞高，在15.6ng水平可見清晰條帶的顯現，同時在4ng可見隱約條帶。
4種染色法的比較顯示，靈敏度蕞高的是銀染法，可達納克級水平，其次為改良考馬斯亮藍染色法，10納克級蛋白質能被檢測。而膠體考馬斯亮藍染色法和經典考馬斯亮藍染色法稍差，檢測水平僅達幾十納克。
4種染色法的雙向電泳蛋白質點顯示比較
來自NB4細胞的全蛋白經pH 3-10NL的等電點梯度分離，SDS-PAGE 二維垂直電泳后被3種考染法著色成像的顯示可以看出傳統考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現蕞少，膠體考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現較多，而改良考馬斯亮藍染色法的蛋白質點顯現geng多。
凝膠背景以后二者為geng清晰。經PDQuest軟件進行分析，3幅圖的蛋白質點顯現數分別為483、679、890。NB4細胞的全蛋白經pH 5-8 IPG分離，分別經改良考馬斯亮藍染色法與銀染法著色成像的蛋白點顯示，二者上樣量一致，蛋白點的顯現數量相當，但銀染的蛋白點明顯顯示著色重。這與單向電泳的效果相同。
4種染色法的可操作性比較
在比較其蛋白質檢測靈敏性的同時，對染色法的操作簡便性、安全性以及蛋白質經質譜鑒定的成功率也作了對比。比較顯示，考馬斯亮藍染方法簡便，但耗時較長，經改進后可以做到無-毒操作，質譜兼容性較高。
銀染步驟繁多，但耗時短;操作過程中有甲醇、甲醛等毒性物的接觸，質譜兼容性低。即使我們選擇的銀染法被文獻報道為質譜兼容的，但仍然表現為低的蛋白鑒定率，不及考馬斯亮藍染
