各種蛋白互作檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)分析
聚焦蛋白質(zhì)互作研究進(jìn)展與實(shí)驗(yàn)方法
研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)是生物信息調(diào)控的主要實(shí)現(xiàn)方式，是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法有哪些？這些檢測(cè)方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)?總結(jié)如下。
1. 生化方法
●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進(jìn)行色譜層析(需要補(bǔ)充)
●蛋白質(zhì)親和色譜 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)。
GST pull down技術(shù)：為了geng有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純?cè)挼牡鞍滓匀诤系鞍椎男问奖磉_(dá)，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過(guò)GSH的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST和GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)載有細(xì)胞抽提物經(jīng)過(guò)柱時(shí)，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。
Epitope-tag技術(shù)：表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原 融合到目的蛋白以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以通過(guò)親和層析法來(lái)純化目的蛋白。 缺點(diǎn)：表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。
以上兩種方法都要共同的缺點(diǎn)：假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的;有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極-強(qiáng)親和力的蛋白。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證。
●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響;可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。 缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。
●Far-Western 又叫做親和印記。將PAGE膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，蕞后顯影。 缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。
2. 等離子表面共振技術(shù)(Surface plasmon resonance)
該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)：需要專(zhuān)門(mén)的等離子表面共振檢測(cè)儀器。
3. 遺傳學(xué)方法
使某處發(fā)生缺損，檢測(cè)對(duì)其他地方的影響。
●基因外抑制子?；蛲庖种谱邮峭ㄟ^(guò)一個(gè)基因的突變 來(lái)彌補(bǔ)原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A和B，如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時(shí)B如果再發(fā)生彌補(bǔ)性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么B就是A的基因外抑制子。 缺點(diǎn)：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費(fèi)時(shí)。
●合成致死篩選 指兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個(gè)基因單獨(dú)發(fā)生突變時(shí)則無(wú)致死效應(yīng)。用于分析兩個(gè)具有相同重要蛋白之間的相互作用。
4. 雙雜交技術(shù)
原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)-立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。 缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。
5. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)
指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近(<100埃)時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。 缺點(diǎn) 此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標(biāo)記。
此外還有交聯(lián)技術(shù)(cross-l
研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)是生物信息調(diào)控的主要實(shí)現(xiàn)方式，是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法有哪些？這些檢測(cè)方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)?總結(jié)如下。
1. 生化方法
●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進(jìn)行色譜層析(需要補(bǔ)充)
●蛋白質(zhì)親和色譜 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose)，當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)。
GST pull down技術(shù)：為了geng有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純?cè)挼牡鞍滓匀诤系鞍椎男问奖磉_(dá)，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過(guò)GSH的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST和GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)載有細(xì)胞抽提物經(jīng)過(guò)柱時(shí)，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標(biāo)蛋白了。
Epitope-tag技術(shù)：表位附加標(biāo)記技術(shù) 就是將附加的抗原 融合到目的蛋白以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以通過(guò)親和層析法來(lái)純化目的蛋白。 缺點(diǎn)：表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或使融合蛋白功能喪失。
以上兩種方法都要共同的缺點(diǎn)：假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的;有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極-強(qiáng)親和力的蛋白。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證。
●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響;可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。 缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。
●Far-Western 又叫做親和印記。將PAGE膠上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，蕞后顯影。 缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。
2. 等離子表面共振技術(shù)(Surface plasmon resonance)
該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射綠上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)：需要專(zhuān)門(mén)的等離子表面共振檢測(cè)儀器。
3. 遺傳學(xué)方法
使某處發(fā)生缺損，檢測(cè)對(duì)其他地方的影響。
●基因外抑制子?；蛲庖种谱邮峭ㄟ^(guò)一個(gè)基因的突變 來(lái)彌補(bǔ)原有基因的突變。比如相互作用的蛋白A和B，如果A發(fā)生了突變使兩者不再相互作用，此時(shí)B如果再發(fā)生彌補(bǔ)性突變就可以使兩者的相互作用恢復(fù)，那么B就是A的基因外抑制子。 缺點(diǎn)：需要知道基因，要有表型，篩選抑制子比較費(fèi)時(shí)。
●合成致死篩選 指兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個(gè)基因單獨(dú)發(fā)生突變時(shí)則無(wú)致死效應(yīng)。用于分析兩個(gè)具有相同重要蛋白之間的相互作用。
4. 雙雜交技術(shù)
原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)-立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。 缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。
5. 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)
指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近(<100埃)時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。 缺點(diǎn) 此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標(biāo)記。
此外還有交聯(lián)技術(shù)(cross-l
