實驗室酶聯免疫技術的質量控制
實驗室酶聯免疫技術的質量控制：
1. 測定模式的影響
ELISA測定模式包括：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結果重復性較差，質量較難控制。
2. ELISA試劑的準備
不同批次的試劑在制作過程中很難保證質量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。
嚴格執行這一標準可以避免因試劑批號改變而重新建立質控體系及重新評估試劑的復雜過程，并且能夠保證結果的穩定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復凍融造成試劑的失效。
試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內質控品及本次不需使用的試劑應密封并及時放回冰箱保存。
3. 操作因素對ELISA結果的影響
目前各種形式的ELISA自動分析儀已經進入市場，如廣泛應用于血站系統的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當前大部分醫學實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。
ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
4. 灰區的設置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”(CO值)，這是定性免疫測定結果報告的依據。由于ELISA CO值的設置不能區分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大(18%～65%)；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產物含量低以及個體差異等，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區域被稱之為“灰區”，在國內的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區”的設置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻血員的篩查具有較大的風險。因此對于檢測結果位于“灰區”的病人可采用確認實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區”的設置有二種方式：一是CO×(1±CV)， CV為該試劑的批內CV (一般在15-20%)；二是CO±2s，s為實驗室做室內質控ROC(常規條件下的變異)的標準差。
5. 標本復查
ELISA手工檢測過程復雜，影響因素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成結果的差異，因此加大復查力度是保證結果準確性的可靠方法。
復查方式主要有：
① 采用同一種試劑復查，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監督管理局（SFDA）認可，嚴格按照其說明書操作，檢測結果具有法律效應，若使用不同的試劑（非確證試驗）復查，當結果不相符合時，則zui終結果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標準”）。
② 采用國外進口試劑進行復查，其理由是盡管進口試劑并不是“金標準”，但實驗室已經對此高度重視，并且使用了質量較好，價格較貴的試劑，但該法對于小醫院而言則很難實施。
6. 結果判斷和報告
① 定性測定
陽性判定值法：一般為陰性對照的平均A值加一個常數，試劑制備、檢測過程必須嚴格標準化，要先計算出陽性對照A值平均數和陰性對照A值平均數。
② 半定量測定：結果一般以滴度表示。將標本連續稀釋后，進行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的zui高稀釋度即為該標本的“滴度”。
③ 定量測定：即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結果以絕-對量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應板都必須繪制相應的標準曲線。
④ 結果報告：傳統的ELISA結果只報告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區”的問題，因此引入“可疑”的報告方式是比較合理和科學的，同時對結果做必要的說明，如“結果已經復查，建議定期復查或定量檢測”；對于HBeAb、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數大等因素，結果缺乏可比性，位于CO值附近的標本復查結果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫療糾紛主要集中點和“結果互認”的zui大障礙，因此在減小室內變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
7. 原始記錄
ELISA檢測結果變異大，不同體系難以溯源，因結果不一致而引起的醫療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測的陰陽結果，檢測者，試劑廠家，批號，質控品來源及批號等。嚴禁人為修改檢測結果。
8. 室內質量控制
① 室內質控品：穩定以及合適的濃度是運用一切質控規則的前提。可選擇S/CO值減去精-密度測定中得到的三倍批間CV%與該S/CO值的乘積仍大于1的質控血清作監測重復性的室內質控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時選擇S/CO處于1.5左右的質控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。
② “即刻性”質控：一些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短，用同一批號試劑盒連續常規測20次，難度較大。采用"即刻法"質控統計方法，只需連續測3次，即可對第3次檢驗結果進行質控。
A. 先將測定值從小到大排列，X1zui小，Xnzui大；
B. 計算X和s；
C. 計算SI上限值和下限值。SI上=（Xzui小-X）/S，SI下=（Xzui大-X）/S；
D. 對照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規定值，在控； SI上或下限>規定值，失控。
③ Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規則質控方法 Levey-Jennings質控圖以及Westgard多規則質控方法zui早應用于生化檢測的質量控制，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認為：
A. 一 次超出3SD；
B. 連續二次超出2SD；
C. 3～5次連續處于一側的2SD之內；
D. 5～7次連續偏向橫軸的一側，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
9. 總結
酶聯免疫試劑盒測定方法是以抗原抗體間的特異反應為基礎的，其與生化的化學反應有著本質的區別，酶聯免疫測定技術從低敏捷的免疫沉淀和免疫凝集反應進入到了高敏捷的放射免疫、酶免疫、熒光免疫和發光免疫測定時代，可見酶聯免疫測定geng多的是用于生物活性物質的微量測定
1. 測定模式的影響
ELISA測定模式包括：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結果重復性較差，質量較難控制。
2. ELISA試劑的準備
不同批次的試劑在制作過程中很難保證質量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。
嚴格執行這一標準可以避免因試劑批號改變而重新建立質控體系及重新評估試劑的復雜過程，并且能夠保證結果的穩定性；對于效期短、使用率低的試劑，應當小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復凍融造成試劑的失效。
試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內質控品及本次不需使用的試劑應密封并及時放回冰箱保存。
3. 操作因素對ELISA結果的影響
目前各種形式的ELISA自動分析儀已經進入市場，如廣泛應用于血站系統的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當前大部分醫學實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。
ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
4. 灰區的設置
通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”(CO值)，這是定性免疫測定結果報告的依據。由于ELISA CO值的設置不能區分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測具有以下幾個特點：檢測變異大(18%～65%)；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產物含量低以及個體差異等，因此在CO值附近存在一個臨床意義可疑的的區域被稱之為“灰區”，在國內的傳染性病原體抗原和抗體檢測的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區”的設置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對獻血員的篩查具有較大的風險。因此對于檢測結果位于“灰區”的病人可采用確認實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。
目前“灰區”的設置有二種方式：一是CO×(1±CV)， CV為該試劑的批內CV (一般在15-20%)；二是CO±2s，s為實驗室做室內質控ROC(常規條件下的變異)的標準差。
5. 標本復查
ELISA手工檢測過程復雜，影響因素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成結果的差異，因此加大復查力度是保證結果準確性的可靠方法。
復查方式主要有：
① 采用同一種試劑復查，理由是市售試劑均通過國家食品藥品監督管理局（SFDA）認可，嚴格按照其說明書操作，檢測結果具有法律效應，若使用不同的試劑（非確證試驗）復查，當結果不相符合時，則zui終結果難以判斷（免疫檢測缺乏“金標準”）。
② 采用國外進口試劑進行復查，其理由是盡管進口試劑并不是“金標準”，但實驗室已經對此高度重視，并且使用了質量較好，價格較貴的試劑，但該法對于小醫院而言則很難實施。
6. 結果判斷和報告
① 定性測定
陽性判定值法：一般為陰性對照的平均A值加一個常數，試劑制備、檢測過程必須嚴格標準化，要先計算出陽性對照A值平均數和陰性對照A值平均數。
② 半定量測定：結果一般以滴度表示。將標本連續稀釋后，進行ELISA檢測，在陽性臨界值以上的zui高稀釋度即為該標本的“滴度”。
③ 定量測定：即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結果以絕-對量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應板都必須繪制相應的標準曲線。
④ 結果報告：傳統的ELISA結果只報告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區”的問題，因此引入“可疑”的報告方式是比較合理和科學的，同時對結果做必要的說明，如“結果已經復查，建議定期復查或定量檢測”；對于HBeAb、HBcAb檢測，由于各試劑盒CO值差異及變異系數大等因素，結果缺乏可比性，位于CO值附近的標本復查結果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測模式及定量檢測模式，報告結果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回避，也是目前醫療糾紛主要集中點和“結果互認”的zui大障礙，因此在減小室內變異的同時必須引入陽性和弱陽性的報告方式。
7. 原始記錄
ELISA檢測結果變異大，不同體系難以溯源，因結果不一致而引起的醫療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測的陰陽結果，檢測者，試劑廠家，批號，質控品來源及批號等。嚴禁人為修改檢測結果。
8. 室內質量控制
① 室內質控品：穩定以及合適的濃度是運用一切質控規則的前提。可選擇S/CO值減去精-密度測定中得到的三倍批間CV%與該S/CO值的乘積仍大于1的質控血清作監測重復性的室內質控品用。 計算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD。同時選擇S/CO處于1.5左右的質控血清以判斷每次測定時試劑盒測定下限的有效性。
② “即刻性”質控：一些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA部分試劑盒效期短，用同一批號試劑盒連續常規測20次，難度較大。采用"即刻法"質控統計方法，只需連續測3次，即可對第3次檢驗結果進行質控。
A. 先將測定值從小到大排列，X1zui小，Xnzui大；
B. 計算X和s；
C. 計算SI上限值和下限值。SI上=（Xzui小-X）/S，SI下=（Xzui大-X）/S；
D. 對照SI表，檢查是否出控。SI上、下限≤規定值，在控； SI上或下限>規定值，失控。
③ Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規則質控方法 Levey-Jennings質控圖以及Westgard多規則質控方法zui早應用于生化檢測的質量控制，在ELISA檢測中仍為探索階段，一般認為：
A. 一 次超出3SD；
B. 連續二次超出2SD；
C. 3～5次連續處于一側的2SD之內；
D. 5～7次連續偏向橫軸的一側，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。
9. 總結
酶聯免疫試劑盒測定方法是以抗原抗體間的特異反應為基礎的，其與生化的化學反應有著本質的區別，酶聯免疫測定技術從低敏捷的免疫沉淀和免疫凝集反應進入到了高敏捷的放射免疫、酶免疫、熒光免疫和發光免疫測定時代，可見酶聯免疫測定geng多的是用于生物活性物質的微量測定
