慢病毒操作步驟和滴度測定注意事項
（一）慢病毒安全操作規范
古朵生物慢病毒載體是第三代慢病毒載體，其 3" LTR 的增強子功能發生缺失，形成了自滅活（sefl-inactivating，SIN）的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 區替換成CMV，是安全的慢病毒載體。但操作者在實驗中仍需保持高度警惕，嚴格按照以下操作規范進行：
1．使用慢病毒載體前請向您所在機構的生物安全部門征得許可和指令。
2. 請在 BL2 生物安全二級生物安全柜中操作病毒粒子。
3. 請務必穿著實驗服，佩戴一次性口罩和手套。
4. 小心操作，避免產生氣霧、飛濺或灑落。
5.被病毒污染的超凈工作臺，請立即用加入1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干凈；請務必 將接觸病毒的槍頭、離心管、培養板、培養液使用新配制的 10％漂、84 消毒液或
0.6%次氯酸鈉溶液浸泡1 小時以上再丟棄。
6. 裝盛慢病毒的實驗用品需單獨放置及培養，并加以標示。
7.用顯微鏡觀察細胞感染情況時，請先擰緊培養瓶或蓋緊培養板，用 70%乙醇擦拭培養 瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實驗臺。
8. 離心病毒時，應使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進行離心，請盡量使用組織培養室內的離心機。
9. 實驗完畢脫掉手套后，請立即用肥皂和水清洗雙手。
10.對共用實驗室的人員需進行慢病毒安全培訓或提示。
（二）慢病毒感染目的細胞預實驗
不同的細胞所使用的病毒 MOI 值會有所不同。建議在正式實驗前，在目的細胞中進行 預實驗摸索佳MOI 值(維真生物）。
為了節省病毒，推薦使用96 孔板進行預實驗。操作步驟如下：
1. 天 細胞的準備
將目的細胞接種于96 孔板中，細胞融合率為 50%為佳。為保證細胞生長良好，請保 證細胞貼壁過夜。
2. 第二天 病毒的稀釋
取10μL 慢病毒原液加入 90μL 培養液中做1:100 稀釋（10-2），以此為起點做梯度稀 釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。
3. 第二天 感染目的細胞
取出提前準備好的96 孔板，用準備好的病毒稀釋液替代舊培養液，注意保留未加入病 毒的細胞孔作為對照組。
4. 第二至十天 觀察熒光或檢測
慢病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后 48、72、96、120小時分別觀察細胞中熒光 表達情況（如果您選擇的產品不帶有熒光標簽，請在 48、72、96、120小時分別收獲細 胞并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達）。
注意事項：由于不同細胞對慢病毒感染過程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，
請于 12-24 小時后觀察細胞狀態以確認加入的病毒量是否合適。
（三）慢病毒滴度測定
維真生物慢病毒單位為TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。 如：病毒滴度為>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108個具有生物活性的慢病毒顆粒。
慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根據熒光蛋白在HEK293細胞中表達量確定，具體操作步驟如下：
1. 天 細胞的準備
在96孔板中的每個孔中接種1-4×104個 HEK293細胞。
2．第二天 病毒的稀釋和感染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋。稀釋方法為：每種病毒準備8個1.5mLEppendorf 管，每管加入297μL完全培養液，向個管中加入33μL病毒原液，混勻后，吸取 30μL加入第二個管混勻。依此類推，做8個稀釋度（10~10-6）。棄去96孔板中原有的培養液，每個稀釋度重復3個孔，每孔加入含稀釋好的病毒液100μL。并做好標記。
1. 第五天 熒光計數和滴度計算
用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數。數出后兩個能觀察到熒光的孔內的熒光細 胞數，計算3個重復孔內的總數之和并計算出平均數，假設為A（倒數第二個能見熒光 孔的熒光細胞平均數）和B（倒數個能見熒光孔的熒光細胞平均數）。 慢病毒病毒滴度計算公式：
病毒滴度(TU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）
（四）慢病毒感染目的細胞
進行慢病毒感染實驗時可使用完全培養液（培養目的細胞用）稀釋。培養液中的血 清、雙抗或其他營養因子不會影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養板為例，進行 HEK293 細胞的感染實驗操作步驟如下：注意事項：實驗前請按照不同的 MOI 設置不同的感染孔，并根據MOI 和細胞數量計 算所需要的病毒量。
1. 天 細胞的準備
在24 孔培養板接種若干孔，每個孔內接種 3-5×104 個HEK 293 細胞，鋪板時細胞的 融合率為 50%左右，每孔培養液體積為 300μL，進行病毒感染時細胞的融合率約為70%左右。
2. 第二天 病毒的準備
根據實驗的實際情況和 MOI 值，用培養液準確稀釋慢病毒原液。 注意事項：可使用PBS 緩沖液或無血清培養液稀釋病毒原液。
3. 第二天 感染目的細胞
在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液， 混勻后放于二氧化碳培養箱（37 ℃、5%CO2）孵育過夜。
注意事項：
1）感染前細胞的狀態好壞對終的感染效果高低影響很大，請務必保證加入病毒前， 細胞處于良好的生長狀態。
2）若慢病毒對目的細胞的感染效率較低，可通過提高 MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培養液中加入助感染試劑 ADV-HR（詳見附錄 1、附錄 4、附錄 5）來提高病毒的感染效率。
4. 第三天 換培養液
病毒感染細胞 24 小時后，換培養液。 注意事項：換液具體時間需視細胞狀態而定。如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用，影 響細胞生長狀態，短可于加病毒 4 小時后換新鮮培養液后繼續培養。
5. 第六天 感染效率檢測 在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計算慢病毒感染目的細胞的效率。如選擇的慢病毒載體 不帶有熒光標記，可以通過 Q-PCR(定量 PCR)檢測目的基因的表達來評估感染效率。
注意事項：
1）慢病毒表達較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染96 小時后觀察熒光的表達。
2）感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察熒光表達的時間和強度來確定慢病毒對目的細胞的感染情況。
3）感染期間，請根據細胞生長的情況及時換液，以保證細胞良好的生長狀
古朵生物慢病毒載體是第三代慢病毒載體，其 3" LTR 的增強子功能發生缺失，形成了自滅活（sefl-inactivating，SIN）的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 區替換成CMV，是安全的慢病毒載體。但操作者在實驗中仍需保持高度警惕，嚴格按照以下操作規范進行：
1．使用慢病毒載體前請向您所在機構的生物安全部門征得許可和指令。
2. 請在 BL2 生物安全二級生物安全柜中操作病毒粒子。
3. 請務必穿著實驗服，佩戴一次性口罩和手套。
4. 小心操作，避免產生氣霧、飛濺或灑落。
5.被病毒污染的超凈工作臺，請立即用加入1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干凈；請務必 將接觸病毒的槍頭、離心管、培養板、培養液使用新配制的 10％漂、84 消毒液或
0.6%次氯酸鈉溶液浸泡1 小時以上再丟棄。
6. 裝盛慢病毒的實驗用品需單獨放置及培養，并加以標示。
7.用顯微鏡觀察細胞感染情況時，請先擰緊培養瓶或蓋緊培養板，用 70%乙醇擦拭培養 瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實驗臺。
8. 離心病毒時，應使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進行離心，請盡量使用組織培養室內的離心機。
9. 實驗完畢脫掉手套后，請立即用肥皂和水清洗雙手。
10.對共用實驗室的人員需進行慢病毒安全培訓或提示。
（二）慢病毒感染目的細胞預實驗
不同的細胞所使用的病毒 MOI 值會有所不同。建議在正式實驗前，在目的細胞中進行 預實驗摸索佳MOI 值(維真生物）。
為了節省病毒，推薦使用96 孔板進行預實驗。操作步驟如下：
1. 天 細胞的準備
將目的細胞接種于96 孔板中，細胞融合率為 50%為佳。為保證細胞生長良好，請保 證細胞貼壁過夜。
2. 第二天 病毒的稀釋
取10μL 慢病毒原液加入 90μL 培養液中做1:100 稀釋（10-2），以此為起點做梯度稀 釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。
3. 第二天 感染目的細胞
取出提前準備好的96 孔板，用準備好的病毒稀釋液替代舊培養液，注意保留未加入病 毒的細胞孔作為對照組。
4. 第二至十天 觀察熒光或檢測
慢病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后 48、72、96、120小時分別觀察細胞中熒光 表達情況（如果您選擇的產品不帶有熒光標簽，請在 48、72、96、120小時分別收獲細 胞并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達）。
注意事項：由于不同細胞對慢病毒感染過程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，
請于 12-24 小時后觀察細胞狀態以確認加入的病毒量是否合適。
（三）慢病毒滴度測定
維真生物慢病毒單位為TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。 如：病毒滴度為>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108個具有生物活性的慢病毒顆粒。
慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根據熒光蛋白在HEK293細胞中表達量確定，具體操作步驟如下：
1. 天 細胞的準備
在96孔板中的每個孔中接種1-4×104個 HEK293細胞。
2．第二天 病毒的稀釋和感染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋。稀釋方法為：每種病毒準備8個1.5mLEppendorf 管，每管加入297μL完全培養液，向個管中加入33μL病毒原液，混勻后，吸取 30μL加入第二個管混勻。依此類推，做8個稀釋度（10~10-6）。棄去96孔板中原有的培養液，每個稀釋度重復3個孔，每孔加入含稀釋好的病毒液100μL。并做好標記。
1. 第五天 熒光計數和滴度計算
用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數。數出后兩個能觀察到熒光的孔內的熒光細 胞數，計算3個重復孔內的總數之和并計算出平均數，假設為A（倒數第二個能見熒光 孔的熒光細胞平均數）和B（倒數個能見熒光孔的熒光細胞平均數）。 慢病毒病毒滴度計算公式：
病毒滴度(TU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）
（四）慢病毒感染目的細胞
進行慢病毒感染實驗時可使用完全培養液（培養目的細胞用）稀釋。培養液中的血 清、雙抗或其他營養因子不會影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養板為例，進行 HEK293 細胞的感染實驗操作步驟如下：注意事項：實驗前請按照不同的 MOI 設置不同的感染孔，并根據MOI 和細胞數量計 算所需要的病毒量。
1. 天 細胞的準備
在24 孔培養板接種若干孔，每個孔內接種 3-5×104 個HEK 293 細胞，鋪板時細胞的 融合率為 50%左右，每孔培養液體積為 300μL，進行病毒感染時細胞的融合率約為70%左右。
2. 第二天 病毒的準備
根據實驗的實際情況和 MOI 值，用培養液準確稀釋慢病毒原液。 注意事項：可使用PBS 緩沖液或無血清培養液稀釋病毒原液。
3. 第二天 感染目的細胞
在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液， 混勻后放于二氧化碳培養箱（37 ℃、5%CO2）孵育過夜。
注意事項：
1）感染前細胞的狀態好壞對終的感染效果高低影響很大，請務必保證加入病毒前， 細胞處于良好的生長狀態。
2）若慢病毒對目的細胞的感染效率較低，可通過提高 MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培養液中加入助感染試劑 ADV-HR（詳見附錄 1、附錄 4、附錄 5）來提高病毒的感染效率。
4. 第三天 換培養液
病毒感染細胞 24 小時后，換培養液。 注意事項：換液具體時間需視細胞狀態而定。如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用，影 響細胞生長狀態，短可于加病毒 4 小時后換新鮮培養液后繼續培養。
5. 第六天 感染效率檢測 在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計算慢病毒感染目的細胞的效率。如選擇的慢病毒載體 不帶有熒光標記，可以通過 Q-PCR(定量 PCR)檢測目的基因的表達來評估感染效率。
注意事項：
1）慢病毒表達較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染96 小時后觀察熒光的表達。
2）感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察熒光表達的時間和強度來確定慢病毒對目的細胞的感染情況。
3）感染期間，請根據細胞生長的情況及時換液，以保證細胞良好的生長狀
