蛋白質濃度測定常用的三種方法
測定蛋白質濃度的方法有很多，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法，雙縮脲法，BCA方法，Lowry法，考馬斯亮藍法，凱氏定氮法等等 ，今天小編以UV法，BCA法，考馬斯亮藍法，其中的三種方法的測定蛋白質濃度的原理、優缺點、操作以及注意事項做詳細介紹。
UV法
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白 質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受 到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
（1）簡易經驗公式 蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）計算 通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算終結果：
蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D，其中d為測定OD值比色杯的厚度，D為溶液的稀釋倍數
BCA法
原理：BCA（bicincho
BCA 蛋白濃度測定試劑盒，Abbkine的蛋白質定量試劑盒（BCA法）提供一個簡單，快捷，兼容去污劑的方法，準確定量總蛋白。
成分試劑 A100 mL試劑 B2 mL標準蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL
保存條件 運輸溫度：室溫（標準蛋白 4～8 ℃ 運輸）
保存溫度：室溫（標準蛋白 -20 ℃ 保存）
有效日期：12 個月
使用方法
方法一：96 孔板
1. 配制 BCA 工作液：根據標準品和樣品數量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標準品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標準品孔中。加滅菌雙蒸水補足到 10 μL。取 10 μL 待測樣品加入 96 孔板的待測樣品孔中。每個測定要做 2～3 個平行。
3. 向待測樣品孔和蛋白標準品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。
4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標儀 562 nm 波長下測定吸光度。
6. 制作標準曲線。從標準曲線中求出樣品濃度。
方法二：試管法
1. 配制工作液：根據標準品和樣品數量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應。每個測定要做 2～3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規格不同，體系需要放大到實驗將采用的比色杯準確讀數所需要的體積。
2. BSA 標準品和樣品的準備：樣品用水或其它不干擾顯色反應的緩沖液配制，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備 3 個平行測定。標準曲線一般 5~6 個點即可。根據樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標準品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標準蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標準品在 562 nm 波長下測定吸光度。
考馬斯亮藍法
實驗原理：考馬斯亮藍 (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。目前，這一方法是也靈敏度高的蛋白質測定法之一。
考馬斯亮藍 G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變為 595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結合。
突出優點
（1）靈敏度高，據估計比 Lowry 法約高四倍，其低蛋白質檢測量可達 1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比 Lowry 法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時內保持穩定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩定性好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費時和需要嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測定法。
缺點
（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 g-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
試劑與器材
1、試劑 考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
2、標準和待測蛋白質溶液
（1）標準蛋白質溶液
結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待測蛋白質溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
3、器材 試管 1.5×15 cm（×6），試管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。
操作方法 一、制作標準曲線 取 7 支試管，按下表平行操作。
搖勻，1 h 內以 0 號管為空白對照，在 595 nm 處比色。
繪制標準曲線：以 A595 nm 為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
二、未知樣品蛋白質濃度測定 測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的 A595 nm 值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/mL）。
注意事項
（1）在試劑加入后的 5-20 min 內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是穩定的。
（2）測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
（3）利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。
UV法
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白 質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受 到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
（1）簡易經驗公式 蛋白質濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）計算 通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算終結果：
蛋白質濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D，其中d為測定OD值比色杯的厚度，D為溶液的稀釋倍數
BCA法
原理：BCA（bicincho
BCA 蛋白濃度測定試劑盒，Abbkine的蛋白質定量試劑盒（BCA法）提供一個簡單，快捷，兼容去污劑的方法，準確定量總蛋白。
成分試劑 A100 mL試劑 B2 mL標準蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL
保存條件 運輸溫度：室溫（標準蛋白 4～8 ℃ 運輸）
保存溫度：室溫（標準蛋白 -20 ℃ 保存）
有效日期：12 個月
使用方法
方法一：96 孔板
1. 配制 BCA 工作液：根據標準品和樣品數量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標準品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標準品孔中。加滅菌雙蒸水補足到 10 μL。取 10 μL 待測樣品加入 96 孔板的待測樣品孔中。每個測定要做 2～3 個平行。
3. 向待測樣品孔和蛋白標準品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。
4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標儀 562 nm 波長下測定吸光度。
6. 制作標準曲線。從標準曲線中求出樣品濃度。
方法二：試管法
1. 配制工作液：根據標準品和樣品數量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測定所用的比色杯對應。每個測定要做 2～3 個平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規格不同，體系需要放大到實驗將采用的比色杯準確讀數所需要的體積。
2. BSA 標準品和樣品的準備：樣品用水或其它不干擾顯色反應的緩沖液配制，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備 3 個平行測定。標準曲線一般 5~6 個點即可。根據樣品的估測濃度確定各點的具體濃度。稀釋 BSA 時可以用水或與樣品一致的溶液。如待測樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標準品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標準蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標準品在 562 nm 波長下測定吸光度。
考馬斯亮藍法
實驗原理：考馬斯亮藍 (Coomassie Brilliant Blue) 法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。目前，這一方法是也靈敏度高的蛋白質測定法之一。
考馬斯亮藍 G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變為 595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結合。
突出優點
（1）靈敏度高，據估計比 Lowry 法約高四倍，其低蛋白質檢測量可達 1 mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比 Lowry 法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時內保持穩定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩定性好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費時和需要嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測定法。
缺點
（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍染色法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 g-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
試劑與器材
1、試劑 考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
2、標準和待測蛋白質溶液
（1）標準蛋白質溶液
結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待測蛋白質溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
3、器材 試管 1.5×15 cm（×6），試管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒溫水浴；分光光度計。
操作方法 一、制作標準曲線 取 7 支試管，按下表平行操作。
搖勻，1 h 內以 0 號管為空白對照，在 595 nm 處比色。
繪制標準曲線：以 A595 nm 為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
二、未知樣品蛋白質濃度測定 測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內。根據所測定的 A595 nm 值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/mL）。
注意事項
（1）在試劑加入后的 5-20 min 內測定光吸收，因為在這段時間內顏色是穩定的。
（2）測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
（3）利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用，重復測定吸光度時，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標準曲線的時候，蛋白標準品好是從低濃度到高濃度測定，防止誤差。
