一、無菌操作要求

1.接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。

2.進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用。

3.接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球將手擦干凈。

4.進行接種所用的吸管，平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。

5.從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。

6.接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。

7.接種環和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環和針與桿的連接處，接種結核菌和烈性菌的接種環應在沸水中煮沸5min，再經火焰燒灼。

8.吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

二、無菌間使用要求

1、無菌間通向外面的窗戶應為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設有與無菌間大小相應的緩沖間及推拉門，另設有0.5-0.7平方米的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2、無菌間內應保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關的物品。

3、無菌間使用前后應將門關緊，打開紫外燈，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。

4、處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。

5、在無菌間內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養基、被污染和接種的培養物等，必須經滅菌后方能使用。

（一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法

1、滅菌前準備

（1）所有需要滅菌的物品首先應清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將上面通氣孔打開。

（2）裝培養基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。

2、裝放

（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。

（2）大型高壓蒸氣鍋：：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。

3、設備檢查

（1）檢查門的開關是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。

（2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行：

①手提式高壓鍋在主體內加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應將水量補足，水變混濁需換）.

②手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。

③蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）。

④關閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規定要求，并維持規定時間（按滅菌物品性質與有關情況而定）。

⑤達到規定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60℃以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。

（3）臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行：

①關緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預熱，夾層內冷空氣經阻氣器自動排出。

②夾層達到預定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內冷空氣經鍋室阻氣器自動排出。

③待鍋室達到規定的壓力與溫度時，調節進氣閥，使保持恒定至

④自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破。

⑤使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關緊門后，應根據物品類別按動相應開關，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應嚴格按照廠家說明書進行。

4、滅菌溫度與時間

（1）干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5-2h。

（2）壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間

（二）間歇滅菌方法

1、滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。

（1）將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內余水排盡。

（2）關閉排水口，打開進氣門，根據需要消毒10～20min。

（3）滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。

2、血清凝固器使用方法，培養基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。

（1）在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后使用。

（2）將培養基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75～90℃1h滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3、煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5～15min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min，加入0.02%甲醛，80℃煮60min均可達到滅菌目的，但選用煮沸消毒的增消劑時，應注意對物品的腐蝕性。

4、滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應仔細檢查放置，以免再度污染。

（1）物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用。

（2）取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用。

（3）培養基或試劑等，應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態，未達到者應廢棄。

（4）啟閉式容器，在取出時應將篩孔關閉。

（5）取出的物品掉落在地或誤放不潔這處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。

（6）取出的合格滅菌物品，應存放于貯藏室或防塵柜內，嚴禁與未滅菌物品混放。

（7）凡屬合格物品，應標有滅菌日期及有效期限。

（8）每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

四、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。

1、經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在地點，待統一進行高壓滅菌。

2、經微生物污染的培養物，必須經121℃30min高壓滅菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃30min高壓滅菌。

4、涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。

5、打碎的培養物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。

五、培養基制備要求

培養基制備的質量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養要求不完全相同，培養目的的不同，各種培養基制備要求如下：

1、根據培養基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥品應進行質量檢驗。

2、PH測定及調節：PH測定要在培養基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應再測試一次。培養基PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養基的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完PH后再加入。

3、培養基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。

4、盛裝培養基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。

5、培養基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養價值，一般121℃15min即可，如為含有不耐高熱物質的培養基如糖類、血清、明膠等，則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。

6、每批培養基制備好后，應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養基，使用標準菌株接種培養，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。

7、目前各種干燥培養基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察，各種培養基用相應菌株生長試驗良好后方可應用，新購進的或存放過久的干燥培養基，在配制時也應測PH，使用時需根據產品說明書用量和方法進行。

8、每批制備的培養基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄，以備查詢。

六、樣品采集及處理要求

1、所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在。

2、根據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。

3、采樣應注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消物滅菌，不能含有此類消物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。

4、樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存狀態下送檢。

5、檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發現有下列情況之一者，可拒絕檢驗。

（1）樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。

（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。

（3）按規定采樣數量不足者。

對送檢符合要求的樣品，檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創造條件，然后進行檢驗。

6、樣品檢驗時，根據其不同性狀，進行適當處理。

（1）液體樣品接種時，應充分混合均勻，按量吸取進行接種。

（2）固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。

（3）瓶、袋裝食品應用滅菌操作啟開，根據性狀選擇上述方法處理后接種。

七、記錄和報告的要求

1、檢驗室收到樣品后，首行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環境中微生物污染。

2、樣品檢驗過程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出試驗紀錄，以作為對結果分析、判定的依據，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造