隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)來認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為當(dāng)代生物醫(yī)藥研發(fā)的關(guān)注點(diǎn)之一。為了研究蛋白質(zhì)，首先需要進(jìn)行蛋白分離和重組蛋白純化，來得到高度純化并且具有生物活性的蛋白質(zhì)。由于每一種蛋白的性質(zhì)都有不同，所以沒有一種通用的蛋白純化方法，但是總的來說，一般影響重組蛋白純化的因素主要有以下幾種：

1、蛋白的屬性

在進(jìn)行重組蛋白純化時(shí)，需要盡可能多的了解蛋白的屬性。如蛋白的化學(xué)性質(zhì)，是否容易被蛋白酶降解，是否會(huì)和一些金屬離子、化學(xué)成分發(fā)生反應(yīng)。蛋白的物理性質(zhì)，是否對(duì)溫度敏感等。還有目的蛋白表達(dá)的定位，目的蛋白表達(dá)在胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間還是胞外等。

2、細(xì)胞內(nèi)形成的區(qū)域與形式

細(xì)胞內(nèi)區(qū)域化指的是模型細(xì)胞器對(duì)細(xì)胞的分割作用。內(nèi)膜系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)個(gè)彼此隔離、相互的功能性結(jié)構(gòu)區(qū)域，稱為細(xì)胞內(nèi)房室化或區(qū)域化。細(xì)胞內(nèi)區(qū)域化可以擴(kuò)大細(xì)胞內(nèi)的表面積，為提高細(xì)胞代謝功能奠定基礎(chǔ)，還可以形成細(xì)胞內(nèi)不同的特殊微環(huán)境，有效提高了細(xì)胞新陳代謝的質(zhì)量和效率。細(xì)胞內(nèi)區(qū)域化還形成了一個(gè)嚴(yán)密而完善的細(xì)胞內(nèi)體系。

3、蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇

一般來說蛋白表達(dá)的量依賴于所選擇的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。如對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性，需要選擇抗毒性的表達(dá)系統(tǒng)。而且不同表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等和培養(yǎng)方法都顯著影響下游的處理過程。

4、菌株的背景

在重組蛋白純化的研究中，尤其是大腸桿菌表達(dá)純化時(shí)，需要注意宿主菌的選擇。多數(shù)人會(huì)直接選擇自己實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因，即使表達(dá)結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會(huì)考究菌株的選擇是否適合。菌株的背景很重要，如菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。在決定是否使用何種菌株時(shí)，還需要注意不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)粒或者已經(jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。

而且為了得到正確折疊的目的蛋白，在誘導(dǎo)方式的選擇上，需要考慮表達(dá)菌株的一些情況。如表達(dá)菌種的生長情況，菌種是否健壯、是否是單克隆菌種、菌體的濃度是否適合誘導(dǎo)。生長狀態(tài)不好的表達(dá)菌，一方面會(huì)造成目的蛋白的錯(cuò)誤折疊，造成蛋白大小、形態(tài)等發(fā)生改變，另一方面會(huì)因?yàn)镮PTG的加入，導(dǎo)致菌體死亡或者降解。

5、表達(dá)蛋白的應(yīng)用

蛋白表達(dá)、分離、純化可以探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理、供作結(jié)構(gòu)與功能的研究和作為催化劑、營養(yǎng)劑等。選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。

培養(yǎng)條件的選擇也很重要，在實(shí)際的操作中，需要根據(jù)實(shí)際情況先小量摸索蛋白純化條件，待佳條件確定，可以按照比例放大來純化目的蛋白