實時熒光定量PCR技術原理與操作
實時熒光定量PCR（Real time
PCR）是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現了實時監測整個PCR進程，并對起始模板進行定量分析的方法。其涉及領域包括：臨床疾病診斷、動物檢驗檢疫、食品安全和科學研究等。在xin型guan狀病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革熱、感染性腹瀉等的檢測、診斷和治療上發揮著重要作用。
實時熒光定量PCR法可分別為SYBR Green l熒光染料法和Taqman探針法。日常進行核酸檢測就是運用Taqman探針法，新guan病毒核酸檢測也是利用此項技術。該法高度特異，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。
在Taqman探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針的5’端標記有報告基團（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端標記有熒光淬滅基團（Quencher，Q），如TAMRA等。當探針完整時，報告基團所發射的熒光被淬滅基團吸收，儀器不能檢測信號。隨著PCR反應的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3’→5’外切核酸酶活性被探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，能量不能被吸收，就產生熒光信號。因此每經過一個循環，熒光信號就和目的片段一樣有一個同步指數增長過程。
這里涉及基線和CT值的概念?；€是用來確定背景的熒光信號強度的參比對照，相當于PCR指數擴增期以前的熒光強度水平。CT值是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底指數增長階段的拐點所對應的循環次數，其由擴增反應體系中模板的初始濃度決定。
與傳統PCR相比，實時熒光定量PCR有著以下優點：
1．檢測結果既可以定性，也可以定量；
2．檢測靈敏度高；
3．無需進行凝膠電泳實驗，節省實驗時間，提高了效率。
圖1 Taqman探針法工作原理
圖2 實時熒光定量PCR的幾個主要參數
