電泳的基本原理及影響顆粒電泳速度的因素
一、基本原理
不同帶電顆粒，因其所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小等差異，使其在同一電場強度、相同的支持介質(zhì)和緩沖液的條件下，各自的泳動速度不同，從而使各種不同的帶電顆粒如蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子得以分離。帶電顆粒在電場中泳動速度以遷移率(mobility)表示。故遷移率可定義為帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度，是指在1V／m的電場作用下，帶電顆粒每秒鐘移動的距離(m)，其移動速率為m／s，遷移率以m2／(V·s)表示。而在實際應(yīng)用中以cm2／(V·s)表示，因此通過測量d、l、V、t，便可計算遷移率。
二、影響顆粒電泳速度的因素
1．測試樣品
(1)電荷
在電場中，帶電顆粒向各自相反方向的電極泳動。若同時帶有正、負兩種電荷,其移動方向取決于凈電荷，其遷移率與凈電荷的大小成正比。大部分生物大分子如蛋白質(zhì)都帶有陰離子和陽離子基因，是典型的兩性電解質(zhì)。帶電的性質(zhì)和多少取決于該物質(zhì)的pKa、溶液的pH值及離子強度。
(2)顆粒大小、形狀和分子量
大的球形分子，在固相或凝膠穩(wěn)定的基質(zhì)中，在非常稀的溶液中，其遷移率與球的半徑成反比。而分子量小于5000的肽類或離子，其遷移率與顆粒半徑的平方成反比，或與其分子量的2／3次方成反比。其遷移率與顆粒凈電荷和分子大小的關(guān)系,同樣大小的分子，因其形狀不同，如纖維蛋白與球蛋白，在電泳時，與周圍介質(zhì)的磨擦力和靜電力不同，遷移率也不同。
2．電場強度
電場強度是指每1厘米的電位降，故又稱電位梯度，以V／cm表示。電場強度對泳動速度起決定性作用。在一定范圍內(nèi)，電場強度愈高，帶電顆粒泳動愈快，根據(jù)不同電泳所需電場強度，可分為常壓電泳和高壓電泳。常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般為500～10000V。紙電泳、醋酸纖維電泳、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳只需200～500V,而固相pH值梯度等電聚焦電泳則需要3000～5000V高壓。電壓與支持介質(zhì)的長度有關(guān)，而電流與支持介質(zhì)的橫截面(或?qū)挾?成正比。大部分電泳用恒壓控制電場強度。在做管狀圓盤電泳時，一般用調(diào)節(jié)每管的電流(mA)控制電場強度，在電泳過程中，保持穩(wěn)定的電場強度或穩(wěn)定的電流，是電泳成功與否的重要條件。
3．緩沖液
(1)pH值
溶液的pH值直接影響帶電顆粒的解離程度，并決定其所帶凈電荷的性質(zhì)和多少。氨基酸、蛋白質(zhì)均為可解離的兩性分子，pH值離等電點越遠，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度愈快。當在某一pH值時，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負電荷數(shù)，即凈電荷等于零時，蛋白質(zhì)在電場中不移動。此時溶液的pH值，即為該蛋白質(zhì)的等電點。因此，在分離蛋白質(zhì)混合物時，應(yīng)選擇合適的pH值，使各種蛋白質(zhì)所帶的電荷差異較大而彼此分開。在電泳過程中，為了使溶液的pH值保持恒定，必須選用緩沖溶液。
(2)離子強度
離子強度高，遷移率小，反之則大。但離子強度過低時，遷移率反而會因?qū)щ姸鹊慕档投鴾p少，一般適宜的離子強度為0.02～0.20。緩沖液離子強度的選擇，取決于待測樣品的組分。其緩沖作用應(yīng)在整個電泳過程使pH值保持恒定。當增加離子強度時，使分離得到的蛋白區(qū)帶窄或斑點為集中。
4．溶液的溫度和黏度
因溶液的黏度與溫度有關(guān)，故溫度間接影響電泳遷移率。在0～5℃時，溫度升高l℃，水的黏度下降約3％，而在室溫時，溫度的改變對黏度影響較小。因此遷移率隨溫度的升高而增加。當電流通過支持介質(zhì)和緩沖液時，會放出大量的熱量，而熱量隨電壓和離子強度的增加而加大，當熱量增至一定程度時，其產(chǎn)生的溫度梯度在電泳槽中會導致分離區(qū)帶失真，故在使用高壓和高離子強度緩沖液電泳時，必須使用冷卻裝置。
5．電內(nèi)滲
在電場作用下，液體對于固體支持介質(zhì)的相對移動稱電內(nèi)滲(eletroendosmosis，EEO)。由于固體支持介質(zhì)吸附水中的正或負離子，使溶液帶電，在電場下，溶液就向一定的方向移動，產(chǎn)生電滲現(xiàn)象。
如在紙電泳中，濾紙吸附羥基使表面帶負電荷，而與紙接觸的水溶液帶正電荷，此時液體便向負極移動，并攜帶顆粒(包括中性顆粒)同時移動，故在電泳時顆粒泳動的表面速度是顆粒本身的電泳速度與由于水溶液移動產(chǎn)生的電滲速度的矢量和。當電內(nèi)滲向負極移動時，帶正電的顆粒也向負極移動，則其表觀移動速度將比電泳速度快，若顆粒原向正極移動，則表觀速度將比電泳速度慢。為校正這一誤差，可用中性物質(zhì)如葡聚糖、糊精與樣品同時做電泳，然后將中性物質(zhì)的移動距離扣除后再測量泳動距離。
電內(nèi)滲因支持介質(zhì)表面帶電基團的多少而異，在瓊脂糖凝膠中，能看到較明顯的電內(nèi)滲現(xiàn)象，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電內(nèi)滲現(xiàn)象可以忽略不計。因此，在做大分子物質(zhì)等電聚焦時，必須使用電內(nèi)滲很小的瓊脂糖，電內(nèi)滲大的瓊脂糖會使pH值梯度向陰極漂移，得不到正確的等電點。sjgma試劑手冊在瓊脂糖規(guī)格中均標出電內(nèi)滲(EEO)值，應(yīng)根據(jù)不同實驗要求選用不同規(guī)格的瓊脂糖。
6．分子篩效應(yīng)
在不同濃度和交聯(lián)度的凝膠中，其孔徑大小不同，通過分子篩效應(yīng)可將不同大小的顆粒進行分離，其分離機制是小分子通過凝膠微孔，而大分子顆粒難通過微孔而使遷移阻滯，從而將被分離的顆粒，按分子大小的順序排列進行分離
不同帶電顆粒，因其所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小等差異，使其在同一電場強度、相同的支持介質(zhì)和緩沖液的條件下，各自的泳動速度不同，從而使各種不同的帶電顆粒如蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子得以分離。帶電顆粒在電場中泳動速度以遷移率(mobility)表示。故遷移率可定義為帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度，是指在1V／m的電場作用下，帶電顆粒每秒鐘移動的距離(m)，其移動速率為m／s，遷移率以m2／(V·s)表示。而在實際應(yīng)用中以cm2／(V·s)表示，因此通過測量d、l、V、t，便可計算遷移率。
二、影響顆粒電泳速度的因素
1．測試樣品
(1)電荷
在電場中，帶電顆粒向各自相反方向的電極泳動。若同時帶有正、負兩種電荷,其移動方向取決于凈電荷，其遷移率與凈電荷的大小成正比。大部分生物大分子如蛋白質(zhì)都帶有陰離子和陽離子基因，是典型的兩性電解質(zhì)。帶電的性質(zhì)和多少取決于該物質(zhì)的pKa、溶液的pH值及離子強度。
(2)顆粒大小、形狀和分子量
大的球形分子，在固相或凝膠穩(wěn)定的基質(zhì)中，在非常稀的溶液中，其遷移率與球的半徑成反比。而分子量小于5000的肽類或離子，其遷移率與顆粒半徑的平方成反比，或與其分子量的2／3次方成反比。其遷移率與顆粒凈電荷和分子大小的關(guān)系,同樣大小的分子，因其形狀不同，如纖維蛋白與球蛋白，在電泳時，與周圍介質(zhì)的磨擦力和靜電力不同，遷移率也不同。
2．電場強度
電場強度是指每1厘米的電位降，故又稱電位梯度，以V／cm表示。電場強度對泳動速度起決定性作用。在一定范圍內(nèi)，電場強度愈高，帶電顆粒泳動愈快，根據(jù)不同電泳所需電場強度，可分為常壓電泳和高壓電泳。常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般為500～10000V。紙電泳、醋酸纖維電泳、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳只需200～500V,而固相pH值梯度等電聚焦電泳則需要3000～5000V高壓。電壓與支持介質(zhì)的長度有關(guān)，而電流與支持介質(zhì)的橫截面(或?qū)挾?成正比。大部分電泳用恒壓控制電場強度。在做管狀圓盤電泳時，一般用調(diào)節(jié)每管的電流(mA)控制電場強度，在電泳過程中，保持穩(wěn)定的電場強度或穩(wěn)定的電流，是電泳成功與否的重要條件。
3．緩沖液
(1)pH值
溶液的pH值直接影響帶電顆粒的解離程度，并決定其所帶凈電荷的性質(zhì)和多少。氨基酸、蛋白質(zhì)均為可解離的兩性分子，pH值離等電點越遠，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度愈快。當在某一pH值時，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負電荷數(shù)，即凈電荷等于零時，蛋白質(zhì)在電場中不移動。此時溶液的pH值，即為該蛋白質(zhì)的等電點。因此，在分離蛋白質(zhì)混合物時，應(yīng)選擇合適的pH值，使各種蛋白質(zhì)所帶的電荷差異較大而彼此分開。在電泳過程中，為了使溶液的pH值保持恒定，必須選用緩沖溶液。
(2)離子強度
離子強度高，遷移率小，反之則大。但離子強度過低時，遷移率反而會因?qū)щ姸鹊慕档投鴾p少，一般適宜的離子強度為0.02～0.20。緩沖液離子強度的選擇，取決于待測樣品的組分。其緩沖作用應(yīng)在整個電泳過程使pH值保持恒定。當增加離子強度時，使分離得到的蛋白區(qū)帶窄或斑點為集中。
4．溶液的溫度和黏度
因溶液的黏度與溫度有關(guān)，故溫度間接影響電泳遷移率。在0～5℃時，溫度升高l℃，水的黏度下降約3％，而在室溫時，溫度的改變對黏度影響較小。因此遷移率隨溫度的升高而增加。當電流通過支持介質(zhì)和緩沖液時，會放出大量的熱量，而熱量隨電壓和離子強度的增加而加大，當熱量增至一定程度時，其產(chǎn)生的溫度梯度在電泳槽中會導致分離區(qū)帶失真，故在使用高壓和高離子強度緩沖液電泳時，必須使用冷卻裝置。
5．電內(nèi)滲
在電場作用下，液體對于固體支持介質(zhì)的相對移動稱電內(nèi)滲(eletroendosmosis，EEO)。由于固體支持介質(zhì)吸附水中的正或負離子，使溶液帶電，在電場下，溶液就向一定的方向移動，產(chǎn)生電滲現(xiàn)象。
如在紙電泳中，濾紙吸附羥基使表面帶負電荷，而與紙接觸的水溶液帶正電荷，此時液體便向負極移動，并攜帶顆粒(包括中性顆粒)同時移動，故在電泳時顆粒泳動的表面速度是顆粒本身的電泳速度與由于水溶液移動產(chǎn)生的電滲速度的矢量和。當電內(nèi)滲向負極移動時，帶正電的顆粒也向負極移動，則其表觀移動速度將比電泳速度快，若顆粒原向正極移動，則表觀速度將比電泳速度慢。為校正這一誤差，可用中性物質(zhì)如葡聚糖、糊精與樣品同時做電泳，然后將中性物質(zhì)的移動距離扣除后再測量泳動距離。
電內(nèi)滲因支持介質(zhì)表面帶電基團的多少而異，在瓊脂糖凝膠中，能看到較明顯的電內(nèi)滲現(xiàn)象，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電內(nèi)滲現(xiàn)象可以忽略不計。因此，在做大分子物質(zhì)等電聚焦時，必須使用電內(nèi)滲很小的瓊脂糖，電內(nèi)滲大的瓊脂糖會使pH值梯度向陰極漂移，得不到正確的等電點。sjgma試劑手冊在瓊脂糖規(guī)格中均標出電內(nèi)滲(EEO)值，應(yīng)根據(jù)不同實驗要求選用不同規(guī)格的瓊脂糖。
6．分子篩效應(yīng)
在不同濃度和交聯(lián)度的凝膠中，其孔徑大小不同，通過分子篩效應(yīng)可將不同大小的顆粒進行分離，其分離機制是小分子通過凝膠微孔，而大分子顆粒難通過微孔而使遷移阻滯，從而將被分離的顆粒，按分子大小的順序排列進行分離
