免疫親和層析技術使用單克隆抗體或經過親和層析純化的多克隆抗體。在某些情況下，可用未純化的多克隆抗體，但一般不使用混合的單克隆抗體。

1. 應用多克隆抗體進行免疫親和層析

使用多克隆抗體進行免疫親和層析有一定的局限性，因為多克隆抗體通常結合抗原分子上的多個表位，雖然親合力高，但洗脫困難。當一種抗原與多種不同的抗體結合后，需要很苛刻的洗脫條件，通常會損壞抗體層析柱，至少也會使部分抗原變性。在這種情況下，每種抗原和抗體相互作用的洗脫條件不同，故難以建立有效的洗脫條件。應用多克隆抗體的另一缺點是其中含有大量針對無關抗原的抗體。

兩種類型的多克隆抗體可以用于免疫親和層析柱，即針對合成肽或某種抗原中特定區域的抗體。在這兩種情況下，由于結合到層析柱上的抗原位點局限在一個很小的區域，因此可能實現有效的洗脫。

如果要將多抗用于免疫親和層析，一種方法是利用抗原親和層析柱來純化特異性的抗體。這種方法要求能得到足夠量的抗原供制備親和層析柱。另一種方法是利用針對某一物種蛋白的抗體，來純化其他物種的同源蛋白。用抗原親和層析柱來純化多克隆抗體時，只需收集與抗原結合的抗體，因為是從抗原上洗脫下來的，從免疫親和層析柱上洗脫抗原的條件已經確定，故不存在問題。

2. 應用單克隆抗體進行免疫親和層析

應用單克隆抗體進行免疫親和層析具有許多優點。單克隆抗體的來源不受限制，而且高親和力的單克隆抗體可以結合抗原的容量大，因為所有的抗體都是均質的，并結合相同的表位，所有結合的抗原可以在相同的條件下被洗脫。由于單克隆抗體結合的是抗原分子上的單一表位，抗原-抗體之間的結合鍵基本上是均質的，洗脫抗原的條件也比使用多克隆抗體容易掌握。

應用單克隆抗體進行免疫親和層析時出現的問題，通常涉及抗原的特性，低親和力或交叉反應，低親和力通常是免疫親和層析法存在的共同問題。使用單克隆抗體時，交叉反應并不常見，主要出現在某些抗體的亞類上，由于抗體與其他抗原上的相同表位結合所致。這些表位可能有廣泛的同源性，這種性質單克隆抗體可用于這些相關蛋白的研究，而不能用于抗原的純化。另一方面，交叉反應可能只限于表位本身。在這種情況下，使用針對該抗原中其他表位的單抗能夠消除交叉反應。另一個解決辦法就是采用其他層析或抽提技術從雜蛋白中純化抗原。

3. 用混合的單克隆抗體進行免疫親和層析

除特殊情況外，一般不應將混合單抗用于制備免疫親和層析柱。使用單克抗體混合物所遇到的與洗脫有關的各種問題已在上面提到。混合單抗通常僅用于純化那些在使用之前需要經過變性的抗原，或制備抗原-抗體-微珠復合物用于免疫動物