流式試劑選擇及常見問題解答
一、如何搭配流式抗體熒光標記
流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。如果流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多
A、 如何根據流式細胞儀搭配流式抗體
1） BD流式細胞儀
流式細胞儀能檢測多少個通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點：
流式細胞儀有哪些激光。比如標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。
不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測熒光素是不一樣的
搭配熒光素原則
搭配流式熒光素有2個原則：每個通道只能選擇1種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意
1、每個通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明，Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們我們搭配的時候只能選擇其中1個。
2、各個通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個熒光素之間可以搭配出16種組合。
比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。總之，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導致補償過度
B、抗體有多少種熒光素
1）供應商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的我們需要根據同時結合供應商能提供的每種抗體的熒光素進行搭配。原則上同一個標志的不同的克隆號帶同1個熒光素在應用上沒有區別的，但是有些不同克隆號的抗體之間可能會有一些稍微的差異，需要仔細看說明書。我們可以盡量選擇在說明書上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類多的克隆號的抗體
2） 熒光素
為什么要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？
因為這些熒光非常明亮，對激光非常穩定，適合流式細胞儀的光譜性質，對PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯合使用時發射光譜存在巨大差異，無需補償。
C、如果檢測的指標數目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型對照（Isotypy Control）
1、為什么要用同型對照？
同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結合而產生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照，它不但可以用來設定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前，染色方式如下：
樣本管：一抗＋樣本
同型對照管：同型對照＋樣本
2、如何選擇同型對照？
一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體，比如抗人的CD56 APC標記的抗體,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是APC標記的Mouse IgG1,&kappa。注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標記的二抗，那么應該選擇一抗的同型對照。比如CDw125的純化抗體，貨號是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE標記的抗小鼠IgG1。那么染色方式如下：
樣本管：純化的CDw25＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本
同型對照管：純化的同型對照＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本
如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優先選擇的順序應該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里面找到不到完全相同的同型對照，那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照。如果后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。
3、如何查找同型對照？
同型對照在BD英文目錄中或者BD網站上跟它對照的抗體的位置是一致的。BD目錄中，抗人的抗體的同型對照都在HUMAN章節后面。抗小鼠的抗體的同型對照在MOUSE章節后面，非人類靈長類的抗體同型對照在NON HUMAN PRIMATE章節后面。由于抗大鼠的抗體非常少，大部分抗體都是小鼠來源的，所以它的同型對照跟小鼠的一樣，放在MOUSE章節后面。胞內細胞因子、趨化因子、補體、炎癥介質及其受體的同型對照放在其章節的后面（注意：人的胞內細胞因子的同型對照跟人的表面標志的同型對照是不在一起的）。Phosflow的同型對照在Phosflow的介紹后面。比如，比如抗人的CD56 APC標記的抗體，成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是在HUMAN章節中Mouse，APC標記的Mouse IgG1,&kappa。
4、哪些客戶需要使用同型對照？
A 對流式不是非常熟悉的客戶。
B 做胞內流式客戶，比如胞內細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。
C 使用不常見的標志或者特異性不高的標志的客戶，因為客戶不熟悉不常見標志的表達情況，根據同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結合非常多，使用同型對照可排除假陽性。
D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標志的客戶一般可以不使用同型對照。
5、為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？
首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在細胞的表面或者胞內表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現象，在細胞表面時如圖所示。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。
三、補償微球
流式細胞儀的熒光補償隔一段時間之后需要調整到適合的位置。如果熒光補償沒有調節好，會導致細胞分群不明顯或者流式檢測得到的結果圖非常不漂亮，而且會影響到檢測結果的不真實。熒光補償的調節對初學者來說非常不容易掌握，同時，補償調節是流式細胞術中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標志檢測時，需要經驗非常豐富的流式操作者根據多年的經驗判斷調節補償，才可以得到比較好的數據和圖片。那么，現在不需要這么麻煩。因為補償微球讓一切變得簡單。BD CompBeads是專用于流式細胞儀多色分析的熒光補償調整微球。它的實用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時補償難調、耗費樣本（往往用待測樣本單標來進行補償調節）的缺點。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結合來調節補償。它不但能象待測的樣本細胞一樣在同樣的實驗條件下固定、破膜等，操作起來很簡單，靈敏度高，一致性好，使補償輕松準確，而且難得的是它適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因為這時的補償往往難度較大。各型號的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時參考用。
流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。如果流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多
A、 如何根據流式細胞儀搭配流式抗體
1） BD流式細胞儀
流式細胞儀能檢測多少個通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點：
流式細胞儀有哪些激光。比如標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。
不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測熒光素是不一樣的
搭配熒光素原則
搭配流式熒光素有2個原則：每個通道只能選擇1種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意
1、每個通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明，Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們我們搭配的時候只能選擇其中1個。
2、各個通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個熒光素之間可以搭配出16種組合。
比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。總之，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導致補償過度
B、抗體有多少種熒光素
1）供應商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的我們需要根據同時結合供應商能提供的每種抗體的熒光素進行搭配。原則上同一個標志的不同的克隆號帶同1個熒光素在應用上沒有區別的，但是有些不同克隆號的抗體之間可能會有一些稍微的差異，需要仔細看說明書。我們可以盡量選擇在說明書上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類多的克隆號的抗體
2） 熒光素
為什么要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？
因為這些熒光非常明亮，對激光非常穩定，適合流式細胞儀的光譜性質，對PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯合使用時發射光譜存在巨大差異，無需補償。
C、如果檢測的指標數目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型對照（Isotypy Control）
1、為什么要用同型對照？
同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結合而產生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照，它不但可以用來設定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前，染色方式如下：
樣本管：一抗＋樣本
同型對照管：同型對照＋樣本
2、如何選擇同型對照？
一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體，比如抗人的CD56 APC標記的抗體,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是APC標記的Mouse IgG1,&kappa。注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標記的二抗，那么應該選擇一抗的同型對照。比如CDw125的純化抗體，貨號是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ。它的二抗PE標記的抗小鼠IgG1。那么染色方式如下：
樣本管：純化的CDw25＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本
同型對照管：純化的同型對照＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本
如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優先選擇的順序應該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里面找到不到完全相同的同型對照，那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照。如果后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。
3、如何查找同型對照？
同型對照在BD英文目錄中或者BD網站上跟它對照的抗體的位置是一致的。BD目錄中，抗人的抗體的同型對照都在HUMAN章節后面。抗小鼠的抗體的同型對照在MOUSE章節后面，非人類靈長類的抗體同型對照在NON HUMAN PRIMATE章節后面。由于抗大鼠的抗體非常少，大部分抗體都是小鼠來源的，所以它的同型對照跟小鼠的一樣，放在MOUSE章節后面。胞內細胞因子、趨化因子、補體、炎癥介質及其受體的同型對照放在其章節的后面（注意：人的胞內細胞因子的同型對照跟人的表面標志的同型對照是不在一起的）。Phosflow的同型對照在Phosflow的介紹后面。比如，比如抗人的CD56 APC標記的抗體，成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是在HUMAN章節中Mouse，APC標記的Mouse IgG1,&kappa。
4、哪些客戶需要使用同型對照？
A 對流式不是非常熟悉的客戶。
B 做胞內流式客戶，比如胞內細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。
C 使用不常見的標志或者特異性不高的標志的客戶，因為客戶不熟悉不常見標志的表達情況，根據同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結合非常多，使用同型對照可排除假陽性。
D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標志的客戶一般可以不使用同型對照。
5、為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？
首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在細胞的表面或者胞內表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現象，在細胞表面時如圖所示。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。
三、補償微球
流式細胞儀的熒光補償隔一段時間之后需要調整到適合的位置。如果熒光補償沒有調節好，會導致細胞分群不明顯或者流式檢測得到的結果圖非常不漂亮，而且會影響到檢測結果的不真實。熒光補償的調節對初學者來說非常不容易掌握，同時，補償調節是流式細胞術中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標志檢測時，需要經驗非常豐富的流式操作者根據多年的經驗判斷調節補償，才可以得到比較好的數據和圖片。那么，現在不需要這么麻煩。因為補償微球讓一切變得簡單。BD CompBeads是專用于流式細胞儀多色分析的熒光補償調整微球。它的實用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時補償難調、耗費樣本（往往用待測樣本單標來進行補償調節）的缺點。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結合來調節補償。它不但能象待測的樣本細胞一樣在同樣的實驗條件下固定、破膜等，操作起來很簡單，靈敏度高，一致性好，使補償輕松準確，而且難得的是它適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因為這時的補償往往難度較大。各型號的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時參考用。
