全面解析Western blot實驗原理
WB是一種把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測。WB采用抗體作為探針，抗體可以與附著在固相支持物的靶蛋白的抗原表位發生抗原-抗體免疫反應。這種技術的作用是對細胞或組織提取的蛋白混合物(即總蛋白混合物)中的某一特異蛋白進行鑒別和半定量分析，旨在鑒別特異性蛋白的類型(如亞型、聚體、剪切體等)和蛋白表達量的變化。
一、蛋白提取
常規的樣品無外乎3種，分別是培養的細胞、動物組織(磨碎或剪碎至肉眼觀察無顆粒)、術中切割的腫瘤細胞。這些樣品需要在裂解液或強去污劑中充分裂解，細胞中的物質(總蛋白、基因、其它內容物等)才能釋放出來，隨后離心取上清液(即總蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸鈉等，這些成分具有較強的表面活性作用和還原作用，可將細胞膜或核膜裂解，釋放其中的物質。同時，裂解液中還包含其它成分，如Tris-Hcl作為緩沖劑，可防止蛋白在提取過程中變性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特異性的聚集而形成聚體等。不同公司生產的裂解液成分大同小異，多是以上成分按不同比例組成，可分為弱、中、強三種不同裂解能力的裂解液。
重要的是我們要清楚自己研究的蛋白到底在細胞哪里表達，是細胞膜、胞漿還是細胞核。這決定我們該使用哪種強度的裂解液。如果裂解不充分，我們抽提的總蛋白中可能已經不包括目標蛋白或目標蛋白隨著沉淀物被丟棄，那么整個WB實驗從一開始就悄無聲息地失敗了。
二、蛋白定量
為什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比較同樣細胞數量的細胞或同等重量的動物組織中目的蛋白的表達量高低變化。那么首先，我們需要控制樣品本身重量大小或細胞數量的多少對實驗結果的影響，故不同組間的樣本需要控制一致才可提取蛋白。因此，在第1步中提取的蛋白上清液即是同等質量下，同樣提取方法下，抽提的總蛋白混合物，這里面包含了各種各樣的蛋白。我們必須知道這個上清液中的總蛋白濃度，才能在第三步電泳時保-證每一個上樣孔中加入的總蛋白質量一致，這樣后面對條帶上的蛋白定量分析才是有意義的。
我們怎樣才能知道這個上清液中，總蛋白的濃度呢？目前有4種方法，分別是雙縮脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。較常用的是BCA法，其原理：蛋白質可在堿性環境下將2價銅離子還原為1價銅離子，而1價銅離子可以與BCA試劑發生顏色反應，2分子的BCA螯合后可形成紫色的復合物，這種復合物具有非常好的吸光性(用OD值反應)。在562nm的紫外光下，溶液中復合物的OD值與蛋白濃度在一定范圍內呈現良好的線性關系。我們可以通過這種線性關系大致地計算出自己的樣品中總蛋白濃度。
自然而然，我們需要一個OD值-蛋白濃度標準曲線。購買商用的蛋白標準品(即包含已知濃度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三種。首先，按照(銅離子體積：BCA regent體積=1：50)配制BCA工作液。準備好4mg/ml蛋白標準品，使用去離子水倍比稀釋蛋白標準品，-后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8個不同濃度的蛋白溶液，單位μg/μl。隨后將自己的要測的樣品按照一定倍數稀釋(因為待測樣品的蛋白濃度肯定是過高而超過BCA檢測的線性范圍，稀釋倍數根據樣本類型和經驗來定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待測樣品(一個孔一個樣品，如待測樣品數量為15，則一共使用標準蛋白梯度濃度的8個孔+15=23個孔，小編建議每個孔做2個復孔，防止加樣誤差)。隨后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使發生紫色螯合反應。孵育結束后立刻拿到酶標儀中，在562nm光下，測算每一個孔的OD值，并通過標準蛋白梯度濃度和其相應的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白濃度線性公式(R方值建議0.99以或以上)；同時根據待測樣品的OD值和上述公式計算出每一份樣品中總蛋白的濃度。
測定完濃度的蛋白根據體積比例加入5X或者1X的蛋白上樣緩沖液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分變性，解除二級或三級結構，只保留一級鏈式結構。上樣緩沖液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的負電荷，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異；DTT還原劑，可打開巰基維持單鏈的線性結構；甘油，可起沉降作用使得混合的樣本沉降到加樣孔底部，不會逸散至加樣孔以外；溴酚藍為小分子藍色物質，有指示作用。
三、SDS-PAGE電泳
終于到了電泳時刻。電泳是為了使得我們的加樣孔中同等質量的總蛋白在相同電場作用下，從配置好的凝膠中由上往下遷移。我們都學過物理，知道帶電物體在電場中移動距離與物體本身的電荷、物體的質量相關。蛋白質本身的電荷、質量、結構是不同的，這些都是影響蛋白在凝膠中移動的因素。通過煮沸，我們讓蛋白僅保留了一級結構；上一步添加的上樣緩沖液中SDS消除蛋白質本身電荷的差異。那么此時，上樣的總蛋白中各種各樣蛋白在凝膠中的遷移距離只與蛋白的質量相關。電泳時，整個凝膠處在一個大致呈“U”型的電場中，因此常能看到電場強度過高時，整條溴酚藍呈現微笑的形狀。
借助電泳時的電場力作用，首先總蛋白在較小電壓下移動到濃縮膠和分離膠的交界處，此時見溴酚藍呈現一條筆直的藍線；隨后，在高電壓的作用下，所有孔道中的蛋白會同時開始向下遷移，一定時間后，總蛋白中各種蛋白會在分離膠中的不同位置中分離開，分離后蛋白所處的水平位置只與蛋白分子量大小有關。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚藍則在下面的位置。每一種分子量的蛋白會在分離膠中形成一條直線，當然我們是看不見這條線的，這也是為什么我們要加溴酚藍的目的，溴酚藍剛好跑出下方玻璃板時，電泳就可以停止了，否則你關注的小分子量蛋白可能會跑出膠外。我們可以通過彩色的Marker來大致地確定目標蛋白在哪里。電轉印的時間和電轉強度需根據蛋白分子量來決定。
四、電轉印
電轉印就是將凝膠中的蛋白，轉移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。這兩種膜表面都有肉眼不可見的小孔，都可以用來電轉印。NC膜全稱硝酸纖維素膜，帶負電荷的蛋白質可以與膜發生疏水作用而結合到一起，價格便宜，韌性差易碎，但易于封閉非特異性結合；PVDF膜全稱聚偏二氟乙烯膜，使用前需用無水甲醇活化(膜表面的正電基團可被無水甲醇活化)，易于吸附蛋白質，價格貴，韌性強，適合小分子量蛋白電轉印。
電轉時，電場線是垂直于我們的凝膠和膜的。因此凝膠中的蛋白質再次在電場作用下向緊貼著凝膠的膜上轉移，并終被吸附在膜的表面。我們可以通過麗春紅染色大致地評價電轉印的情況(麗春紅可將膜上的蛋白染成紅色，而膜其它位置基本不著色)，但是麗春紅染色僅僅是粗糙的評價方法，并不是我們的目標蛋白是否轉移到膜上的直接證據，做＞150KD分子量蛋白的同志們尤其得注意。電轉印的時間和電轉強度需根據蛋白分子量來決定。
五、封閉
一旦電轉印結束，我們就開始了封閉的過程，常采用5%、8%的脫脂奶粉或胎牛血清，室溫下，搖床孵育膜1h。常規采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白時必須使用胎牛血清封閉，因為奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的條帶變淺，甚至消失，同時也可能出現較高背景。
為什么要封閉呢？我們知道，電轉后蛋白質已遷移至膜的表面，而膜上還存在大量的、未吸附蛋白質的小孔。此時我們采用牛奶或胎牛血清封閉，其中包含大量的蛋白質，這些蛋白質會吸附在那些小孔上，堵住這些孔。如果沒有封閉，那么在下一步我們添加的一抗將同時吸附在目標蛋白和膜表面其它位置，且很難洗掉，終ECL發光檢測時可出現非特異性條帶、雜帶、高背景等等，浪費抗體不說，還會影響終的判斷。當然，這些奶粉中的蛋白也會一定程度地吸附到目標蛋白表面，但是與抗原-抗體特異性反應相比，這種非特異性的結合會很輕松的在后面漂洗步驟中消除。
有時候也會遇到未封閉，但沒有出現雜帶。對此，小編只想說，常在河邊走，哪有不濕鞋啊。
六、抗原-抗體免疫反應
這一步是比較簡單的。就是你購買的特異性抗體與你的目標蛋白發生抗原-抗體特異性免疫反應。首先是一抗與目的蛋白表面的抗原表位結合，而膜表面其它位置的孔因為被封閉過程中牛奶的蛋白質所填滿，因此結合量很少，后面漂洗時可去除。比較重要的是一抗孵育溫度和時間，常用的條件是4℃搖床過夜孵育，溫度適宜，分子運動溫和。有人也用37℃孵育1-2h，可能會成功，但是溫度越高，分子間的運動越激烈，那么出現非特異性雜帶的可能性就越高；同時孵育時間較短，也可能會導致一抗與目標蛋白結合不充分。當然，如果你使用的是多克隆抗體，那情況就難說了，參考上上期避雷手冊。一抗結合之后，就是采用二抗，二抗可與一抗結合，而二抗蛋白結構被HRP辣根過氧化物酶標記，可與發光底物相結合，該 底物的信號輸出能夠使皮克量的蛋白得到檢測。
總之，選好自己的一抗是很重要的。特異性高的一抗，WB你怎么做都能出；特異性差的抗體，WB發明人都不一定做得出來。建議不要省錢買國產抗體，你懂得。買抗體之前，看看近年發的高分文章，查查他們用的什么哪個公司抗體。如果找不到參考，一定要買經過該抗體公司敲除驗證過的抗體。
七、蛋白檢測
前幾步，我們幾乎無法看到膜上有啥變化，條帶也看不見在哪，反正就是一直將膜洗洗涮涮。終于到了蛋白檢測，這也是WB-后一步，終于可以一睹蛋白條帶的真容了。
蛋白檢測包括DAB法和ECL發光法。DAB法就是和免疫組化染色類似，出現的條帶在肉眼下即可見，呈現棕黃色，條帶可保存1-2年，但是現在用的較少。目前較多采用的是ECL化學發光法，ECL工作液包括魯米諾(是的，就是我們看刑偵節目時案發現場看血跡的東西)和過氧化物，二者避光保存，現配現用(1：1配制)，用時滴在膜上就行，目標條帶將在黑暗環境下發出熒光，熒光會進一步在膠片上曝光，熒光越強則膠片上曝光的條帶越黑，-后洗出膠片即可。現在還有凝膠成像儀可以使用，省去了膠片曝光和洗膠片的步驟，方便而高-效，再也不用去小黑屋待著發光了
一、蛋白提取
常規的樣品無外乎3種，分別是培養的細胞、動物組織(磨碎或剪碎至肉眼觀察無顆粒)、術中切割的腫瘤細胞。這些樣品需要在裂解液或強去污劑中充分裂解，細胞中的物質(總蛋白、基因、其它內容物等)才能釋放出來，隨后離心取上清液(即總蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸鈉等，這些成分具有較強的表面活性作用和還原作用，可將細胞膜或核膜裂解，釋放其中的物質。同時，裂解液中還包含其它成分，如Tris-Hcl作為緩沖劑，可防止蛋白在提取過程中變性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特異性的聚集而形成聚體等。不同公司生產的裂解液成分大同小異，多是以上成分按不同比例組成，可分為弱、中、強三種不同裂解能力的裂解液。
重要的是我們要清楚自己研究的蛋白到底在細胞哪里表達，是細胞膜、胞漿還是細胞核。這決定我們該使用哪種強度的裂解液。如果裂解不充分，我們抽提的總蛋白中可能已經不包括目標蛋白或目標蛋白隨著沉淀物被丟棄，那么整個WB實驗從一開始就悄無聲息地失敗了。
二、蛋白定量
為什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比較同樣細胞數量的細胞或同等重量的動物組織中目的蛋白的表達量高低變化。那么首先，我們需要控制樣品本身重量大小或細胞數量的多少對實驗結果的影響，故不同組間的樣本需要控制一致才可提取蛋白。因此，在第1步中提取的蛋白上清液即是同等質量下，同樣提取方法下，抽提的總蛋白混合物，這里面包含了各種各樣的蛋白。我們必須知道這個上清液中的總蛋白濃度，才能在第三步電泳時保-證每一個上樣孔中加入的總蛋白質量一致，這樣后面對條帶上的蛋白定量分析才是有意義的。
我們怎樣才能知道這個上清液中，總蛋白的濃度呢？目前有4種方法，分別是雙縮脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。較常用的是BCA法，其原理：蛋白質可在堿性環境下將2價銅離子還原為1價銅離子，而1價銅離子可以與BCA試劑發生顏色反應，2分子的BCA螯合后可形成紫色的復合物，這種復合物具有非常好的吸光性(用OD值反應)。在562nm的紫外光下，溶液中復合物的OD值與蛋白濃度在一定范圍內呈現良好的線性關系。我們可以通過這種線性關系大致地計算出自己的樣品中總蛋白濃度。
自然而然，我們需要一個OD值-蛋白濃度標準曲線。購買商用的蛋白標準品(即包含已知濃度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三種。首先，按照(銅離子體積：BCA regent體積=1：50)配制BCA工作液。準備好4mg/ml蛋白標準品，使用去離子水倍比稀釋蛋白標準品，-后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8個不同濃度的蛋白溶液，單位μg/μl。隨后將自己的要測的樣品按照一定倍數稀釋(因為待測樣品的蛋白濃度肯定是過高而超過BCA檢測的線性范圍，稀釋倍數根據樣本類型和經驗來定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待測樣品(一個孔一個樣品，如待測樣品數量為15，則一共使用標準蛋白梯度濃度的8個孔+15=23個孔，小編建議每個孔做2個復孔，防止加樣誤差)。隨后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使發生紫色螯合反應。孵育結束后立刻拿到酶標儀中，在562nm光下，測算每一個孔的OD值，并通過標準蛋白梯度濃度和其相應的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白濃度線性公式(R方值建議0.99以或以上)；同時根據待測樣品的OD值和上述公式計算出每一份樣品中總蛋白的濃度。
測定完濃度的蛋白根據體積比例加入5X或者1X的蛋白上樣緩沖液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分變性，解除二級或三級結構，只保留一級鏈式結構。上樣緩沖液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的負電荷，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異；DTT還原劑，可打開巰基維持單鏈的線性結構；甘油，可起沉降作用使得混合的樣本沉降到加樣孔底部，不會逸散至加樣孔以外；溴酚藍為小分子藍色物質，有指示作用。
三、SDS-PAGE電泳
終于到了電泳時刻。電泳是為了使得我們的加樣孔中同等質量的總蛋白在相同電場作用下，從配置好的凝膠中由上往下遷移。我們都學過物理，知道帶電物體在電場中移動距離與物體本身的電荷、物體的質量相關。蛋白質本身的電荷、質量、結構是不同的，這些都是影響蛋白在凝膠中移動的因素。通過煮沸，我們讓蛋白僅保留了一級結構；上一步添加的上樣緩沖液中SDS消除蛋白質本身電荷的差異。那么此時，上樣的總蛋白中各種各樣蛋白在凝膠中的遷移距離只與蛋白的質量相關。電泳時，整個凝膠處在一個大致呈“U”型的電場中，因此常能看到電場強度過高時，整條溴酚藍呈現微笑的形狀。
借助電泳時的電場力作用，首先總蛋白在較小電壓下移動到濃縮膠和分離膠的交界處，此時見溴酚藍呈現一條筆直的藍線；隨后，在高電壓的作用下，所有孔道中的蛋白會同時開始向下遷移，一定時間后，總蛋白中各種蛋白會在分離膠中的不同位置中分離開，分離后蛋白所處的水平位置只與蛋白分子量大小有關。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚藍則在下面的位置。每一種分子量的蛋白會在分離膠中形成一條直線，當然我們是看不見這條線的，這也是為什么我們要加溴酚藍的目的，溴酚藍剛好跑出下方玻璃板時，電泳就可以停止了，否則你關注的小分子量蛋白可能會跑出膠外。我們可以通過彩色的Marker來大致地確定目標蛋白在哪里。電轉印的時間和電轉強度需根據蛋白分子量來決定。
四、電轉印
電轉印就是將凝膠中的蛋白，轉移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。這兩種膜表面都有肉眼不可見的小孔，都可以用來電轉印。NC膜全稱硝酸纖維素膜，帶負電荷的蛋白質可以與膜發生疏水作用而結合到一起，價格便宜，韌性差易碎，但易于封閉非特異性結合；PVDF膜全稱聚偏二氟乙烯膜，使用前需用無水甲醇活化(膜表面的正電基團可被無水甲醇活化)，易于吸附蛋白質，價格貴，韌性強，適合小分子量蛋白電轉印。
電轉時，電場線是垂直于我們的凝膠和膜的。因此凝膠中的蛋白質再次在電場作用下向緊貼著凝膠的膜上轉移，并終被吸附在膜的表面。我們可以通過麗春紅染色大致地評價電轉印的情況(麗春紅可將膜上的蛋白染成紅色，而膜其它位置基本不著色)，但是麗春紅染色僅僅是粗糙的評價方法，并不是我們的目標蛋白是否轉移到膜上的直接證據，做＞150KD分子量蛋白的同志們尤其得注意。電轉印的時間和電轉強度需根據蛋白分子量來決定。
五、封閉
一旦電轉印結束，我們就開始了封閉的過程，常采用5%、8%的脫脂奶粉或胎牛血清，室溫下，搖床孵育膜1h。常規采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白時必須使用胎牛血清封閉，因為奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的條帶變淺，甚至消失，同時也可能出現較高背景。
為什么要封閉呢？我們知道，電轉后蛋白質已遷移至膜的表面，而膜上還存在大量的、未吸附蛋白質的小孔。此時我們采用牛奶或胎牛血清封閉，其中包含大量的蛋白質，這些蛋白質會吸附在那些小孔上，堵住這些孔。如果沒有封閉，那么在下一步我們添加的一抗將同時吸附在目標蛋白和膜表面其它位置，且很難洗掉，終ECL發光檢測時可出現非特異性條帶、雜帶、高背景等等，浪費抗體不說，還會影響終的判斷。當然，這些奶粉中的蛋白也會一定程度地吸附到目標蛋白表面，但是與抗原-抗體特異性反應相比，這種非特異性的結合會很輕松的在后面漂洗步驟中消除。
有時候也會遇到未封閉，但沒有出現雜帶。對此，小編只想說，常在河邊走，哪有不濕鞋啊。
六、抗原-抗體免疫反應
這一步是比較簡單的。就是你購買的特異性抗體與你的目標蛋白發生抗原-抗體特異性免疫反應。首先是一抗與目的蛋白表面的抗原表位結合，而膜表面其它位置的孔因為被封閉過程中牛奶的蛋白質所填滿，因此結合量很少，后面漂洗時可去除。比較重要的是一抗孵育溫度和時間，常用的條件是4℃搖床過夜孵育，溫度適宜，分子運動溫和。有人也用37℃孵育1-2h，可能會成功，但是溫度越高，分子間的運動越激烈，那么出現非特異性雜帶的可能性就越高；同時孵育時間較短，也可能會導致一抗與目標蛋白結合不充分。當然，如果你使用的是多克隆抗體，那情況就難說了，參考上上期避雷手冊。一抗結合之后，就是采用二抗，二抗可與一抗結合，而二抗蛋白結構被HRP辣根過氧化物酶標記，可與發光底物相結合，該 底物的信號輸出能夠使皮克量的蛋白得到檢測。
總之，選好自己的一抗是很重要的。特異性高的一抗，WB你怎么做都能出；特異性差的抗體，WB發明人都不一定做得出來。建議不要省錢買國產抗體，你懂得。買抗體之前，看看近年發的高分文章，查查他們用的什么哪個公司抗體。如果找不到參考，一定要買經過該抗體公司敲除驗證過的抗體。
七、蛋白檢測
前幾步，我們幾乎無法看到膜上有啥變化，條帶也看不見在哪，反正就是一直將膜洗洗涮涮。終于到了蛋白檢測，這也是WB-后一步，終于可以一睹蛋白條帶的真容了。
蛋白檢測包括DAB法和ECL發光法。DAB法就是和免疫組化染色類似，出現的條帶在肉眼下即可見，呈現棕黃色，條帶可保存1-2年，但是現在用的較少。目前較多采用的是ECL化學發光法，ECL工作液包括魯米諾(是的，就是我們看刑偵節目時案發現場看血跡的東西)和過氧化物，二者避光保存，現配現用(1：1配制)，用時滴在膜上就行，目標條帶將在黑暗環境下發出熒光，熒光會進一步在膠片上曝光，熒光越強則膠片上曝光的條帶越黑，-后洗出膠片即可。現在還有凝膠成像儀可以使用，省去了膠片曝光和洗膠片的步驟，方便而高-效，再也不用去小黑屋待著發光了
