慢病毒（Lentivirus）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞和原代細(xì)胞。此外，慢病毒具有嗜核性，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期表達(dá)。慢病毒的多種優(yōu)點(diǎn)，使它成為基因傳遞的強(qiáng)大而有效的工具，獲得了廣泛的應(yīng)用。因此，慢病毒成為了實(shí)驗(yàn)室的一大常客。在使用慢病毒的過程中，我們會(huì)遇到一些問題，比如細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞狀態(tài)差等等。為了在實(shí)驗(yàn)過程中好地使用慢病毒，我們應(yīng)該注意哪些問題呢？

慢病毒載體是經(jīng)過處理的HIV，理論上對(duì)人體是無害的，但病毒仍然具有潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)，慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要在生物安全柜（BL-2級(jí)別）內(nèi)進(jìn)行操作。因此在進(jìn)行操作的時(shí)候，我們要按照如下基礎(chǔ)規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：
1、在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作時(shí)，穿著實(shí)驗(yàn)服或隔離服，戴上手套和口罩；
2、操作病毒時(shí)請(qǐng)盡量使用生物安全柜，小心不要產(chǎn)生氣霧或液體飛濺；
3、如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒，請(qǐng)?jiān)诖蜷_含有病毒的容器蓋子前關(guān)閉超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)（由于超凈臺(tái)風(fēng)向外排，有可能將病毒吹向操作者），并盡快操作；盡量縮短開蓋后的病毒在關(guān)閉了排風(fēng)機(jī)的超凈臺(tái)中停留的時(shí)間，封閉所有含有病毒的容器、耗材、廢液后，再打開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)；
4、如果操作時(shí)臺(tái)面有病毒污染，請(qǐng)立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請(qǐng)用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡過夜后棄去；
5、如需離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后離心；
6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，脫掉手套前先消毒再摘除手套，隨后用肥皂洗手。

慢病毒的儲(chǔ)存與稀釋
1、病毒長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80℃冰箱，-20℃保存不要超過1周，4℃保存不要超過3天；
2、病毒的運(yùn)輸采用干冰，收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，可于4℃保存（于3天內(nèi)用完）。若短時(shí)間內(nèi)不用，收到病毒后應(yīng)立即放入-80℃冰箱進(jìn)行長(zhǎng)期保存。病毒使用過程中要避免反復(fù)凍融，否則會(huì)降低病毒滴度；
3、一般病毒可在-80℃存放1年，但存放時(shí)間超過6個(gè)月后使用，需重新檢測(cè)病毒滴度；
4、需要稀釋病毒時(shí)，將病毒從-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解，然后用PBS或培養(yǎng)基（不含血清）稀釋到所需濃度后輕柔混勻，盡快使用；

慢病毒的使用
預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索慢病毒的佳MOI
每種細(xì)胞對(duì)慢病毒的敏感性不同，有些容易感染，有些不容易感染，不同慢病毒的熒光強(qiáng)度也有差異，所以進(jìn)行慢病毒操作實(shí)驗(yàn)之前，首先要了解MOI的概念，MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指病毒感染細(xì)胞的比例。

選擇合適的MOI值，病毒的感染效率以及目的蛋白的表達(dá)量越高，相對(duì)細(xì)胞的毒性越小。對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比如293細(xì)胞MOI=1時(shí)，95%以上的細(xì)胞均可以表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低，MOI值可能達(dá)到200-300。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等）感染細(xì)胞MOI值的摸索。

1、感染前一天，一般用24孔板接種2×10?個(gè)細(xì)胞，第二天病毒感染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到40-50%左右；
2、MOI值的設(shè)置若有文獻(xiàn)參考，可以參考值為中心設(shè)置梯度覆蓋參考值，舉例：文獻(xiàn)中某細(xì)胞系慢病毒MOI值為10，則設(shè)置MOI梯度為2.5,5,10,20,40等；若無文獻(xiàn)參考可按10倍梯度稀釋進(jìn)行設(shè)置，每個(gè)梯度3次重復(fù)；
注：（1）每孔加病毒量（μL）=MOI*細(xì)胞數(shù)/滴度（TU/mL）*10?
一般第二天按照細(xì)胞數(shù)倍增計(jì)算;如果病毒滴度很高，每孔加病毒量過少，可進(jìn)行稀釋后再加；Polybrene（常用濃度為5-10μg/mL）是否添加根據(jù)細(xì)胞種類及具體實(shí)驗(yàn)決定；
3、第三天（加病毒后12h-24h左右），棄去含病毒就培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
4、第五天，觀察熒光情況，并進(jìn)行拍照，確定適合MOI值；
5、對(duì)于生長(zhǎng)緩慢代謝慢的細(xì)胞，可以適當(dāng)延長(zhǎng)病毒感染時(shí)間，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)決定何時(shí)換培養(yǎng)基，保持細(xì)胞的活性。

慢病毒感染目的細(xì)胞
1、通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞接種密度、佳MOI等條件。正式實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整并保持良好的細(xì)胞狀態(tài)；
2、按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板（qPCR檢測(cè)用12孔板，WB檢測(cè)用6孔板或大面積的培養(yǎng)皿），細(xì)胞數(shù)以第2天密度約40-50%為宜，37℃ 培養(yǎng)過夜；
3、感染前，從-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化，用PBS稀釋成所需濃度，用移液器吹打均勻；
4、感染前給細(xì)胞換液，然后向每孔中均勻滴加稀釋好的病毒液，輕輕搖勻，37℃培養(yǎng)過夜；
5、感染后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)決定，換新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。若病毒對(duì)細(xì)胞性也可不換液。感染后48-72h觀測(cè)熒光，拍照記錄；
6、根據(jù)需要，或收細(xì)胞抽提RNA檢測(cè)目的基因在mRNA水平的表達(dá)，或收細(xì)胞抽提蛋白檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，或收細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)；
7、在培養(yǎng)過程中，需要篩選穩(wěn)定攜帶 Puromycin 抗性基因的病毒，則需換上含適當(dāng)濃度 Puromycin 的新鮮完全培養(yǎng)液。

慢病毒在使用過程中可能遇到的其他問題
如何使用慢病毒感染細(xì)胞？
使用慢病毒感染細(xì)胞的操作流程取決于細(xì)胞種類，因此首先要了解細(xì)胞的來源和背景。通常來講首先要根據(jù)MOI和需要感染細(xì)胞量計(jì)算所需要的病毒量，然后將所需病毒液加入培養(yǎng)體系后4小時(shí)左右即可換成完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。
慢病毒染后為什么細(xì)胞中出現(xiàn)大量黑點(diǎn)，并影響細(xì)胞生長(zhǎng)？
在排除細(xì)菌及真菌污染后，細(xì)胞中的黑點(diǎn)通常為細(xì)胞碎片，導(dǎo)致細(xì)胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，細(xì)胞破碎通常有兩個(gè)原因：
a. 慢病毒使用量過多，或細(xì)胞數(shù)量過少；
b. 支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，故支原體污染被許多實(shí)驗(yàn)室所忽略。
但支原體易在病毒感染細(xì)胞后爆發(fā)，故會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片。建議在使用病毒制品時(shí)，應(yīng)首先排除細(xì)胞、培養(yǎng)物及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染，以節(jié)約時(shí)間。

病毒感染目的細(xì)胞感染不上或效率低？
和以下幾個(gè)因素有關(guān)：
1、病毒活性：解凍病毒一定要在冰上進(jìn)行，盡量避免反復(fù)凍融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新測(cè)滴度；
2、目的細(xì)胞：好預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試過，看病毒載體是否合適感染目的細(xì)胞。一些難感染的細(xì)胞，如懸浮細(xì)胞，原代細(xì)胞等，或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)適合用腺病毒或AAV；
3、MOI值：一般來說MOI都是要用梯度法來摸索的，同的病毒感染不同的細(xì)胞的MOI值也不一樣，如果感染細(xì)胞所用的病毒量不夠的話，感染效率肯定不好；需要確認(rèn)MOI計(jì)算及細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。
4、感染時(shí)間：慢病毒一般在感染后24h換液，感染后換液太早會(huì)導(dǎo)致感染效率下降；感染后換液太晚，則對(duì)細(xì)胞的損傷太大，效率也不高。感染后48h開始觀察熒光，由于慢病毒的表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，有的72h，120h才能看到熒光。
5、其他：是否加入 polybrene 以及熒光顯微鏡的使用等因素有關(guān)

要曝光很長(zhǎng)時(shí)間才能觀察到熒光？
要曝光很長(zhǎng)時(shí)間才能觀察到的熒光，說明熒光比較弱，可能的原因有：
1、顯微鏡汞燈使用時(shí)間長(zhǎng)，這個(gè)可以通過對(duì)照排除，看是否有比較亮的對(duì)照，或者如果有其他比較亮的樣品，證明不是汞燈的問題。
2、PH值低，看培養(yǎng)基是否發(fā)黃導(dǎo)致綠色熒光猝滅。
3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比弱一些，這個(gè)屬于正常現(xiàn)象，增加曝光時(shí)間，看感染上的陽性細(xì)胞比例如何，看看目的和對(duì)照的熒光的差異，如果感染比例尚可，差異不是很大，用Puromycin篩選有大量細(xì)胞存活，則病毒也可以使用。