1、抗原提純與動(dòng)物免疫

對(duì)抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1×107個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動(dòng)物免疫。

選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過(guò)程中死亡，可同時(shí)免疫3～4只小鼠。

免疫過(guò)程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動(dòng)物的血清抗體效價(jià)越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過(guò)程中小鼠血清抗體的效價(jià)和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離脾細(xì)胞融合。

2、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

選擇瘤細(xì)胞株的重要的一點(diǎn)是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用多的是Sp2/0細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的高生長(zhǎng)刻度為9×105/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95％）。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2 ×105/ml，次日一般即為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。

在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，切忌針頭刺破動(dòng)物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會(huì)有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1×105/ml，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。

3、細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過(guò)程中有幾個(gè)問(wèn)題應(yīng)特別注意。①細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時(shí)間：在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對(duì)融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營(yíng)養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。

4、有限稀釋法

篩選陽(yáng)性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔），按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36％的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的ELISA測(cè)定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。

5、單克隆抗體的制備和凍存

篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時(shí)甚至超過(guò)40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長(zhǎng)情況適當(dāng)增減。

選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種，凍存過(guò)程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說(shuō)明凍存復(fù)蘇過(guò)程有問(wèn)題.

6、單克隆抗體的純化

單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過(guò)濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡(jiǎn)單的酸沉淀方法。目前有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90％以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測(cè)，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時(shí)，1.44（吸光單位）相當(dāng)于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對(duì)保持純化抗體的活性至關(guān)重要