蛋白純化系統中親和純化常見問題，實驗人看過來！
1. 鎳柱使用中出現棕色是怎么回事?
出現這樣的情況，主要是緩沖液中 DTT 的影響， DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免 DTT 的參與（一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超過2mM DTT）。
2. 通過 His 標簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進？
（1）如果蛋白純化的是上清，蛋白酶會部分降解目的蛋白，可通過加多種蛋白酶控制劑改進。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
（3）雜蛋白和目的蛋白結合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
3. 鎳柱堵了怎么辦？
（1）柱子發生堵塞，可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心。
（2）上清純化時，蛋白發生變性，有絮狀物產生，趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進行)，還不行加尿素變性，使其在變形環境下。
（3）樣品處理時的料液比不要太小，否則黏度大，或者導致蛋白析出或變性，料液比要在1/10-1/15 之間較適宜。
4. 純化過程中，蛋白出現了渾濁，怎么辦？
（1）出現渾濁，說明蛋白處在不穩定的環境中或者自身就不穩定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑 DTT。
（2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現象。
5. 如何處理樣品，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）？
（1）上清樣品處理，要加入去污劑，蛋白酶控制劑，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數。
（2）去大腸桿菌自身帶（兩條 30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸浮（加入去垢劑），離心 6000r/min,30min,10℃。（若效果不夠可繼續上述步驟）。
（3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可選取其中純度較佳的。
（4）可用硫酸銨沉淀法，初步提純。
6. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決？
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上，結合力較強） 策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出較佳的洗脫條件。
（2）降低 PH 的方法洗脫的,因 為若 PH 低于 3.5,會導致鎳離子脫落 策略：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
（3）蛋白已沉淀在柱上 策略：減少上樣量和孵育的時間，試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件下洗脫(用 8M 脲，或 6M 鹽酸胍)，也可在洗脫 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。
（4）非特異性疏水或其他相互反應 策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的濃度。
7. 沒能純化到帶 His 標簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？
（1）超聲的功率不對(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放) ；
策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
（2）樣品或者是結合緩沖液不正確 ；
策略：檢測 pH 及樣品和結合緩沖液的組成份（EDTA）。
（3）組氨酸的標簽沒有完全的暴露 ；
策略：在變性條件下(用 8M 脲，6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進行純化。
（4）His 標簽丟失；
策略 1：WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達，上游構建，改變his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要時增加 his 個數(常用 6-10 個)；
策略 2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間；
策略 3：改變螯合的金屬離子，尋找到較佳的結合金屬離子。
Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(組氨酸)6 標記的重組蛋白質的金屬離子，也是一般常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。
出現這樣的情況，主要是緩沖液中 DTT 的影響， DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免 DTT 的參與（一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超過2mM DTT）。
2. 通過 His 標簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進？
（1）如果蛋白純化的是上清，蛋白酶會部分降解目的蛋白，可通過加多種蛋白酶控制劑改進。
（2）可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。
（3）雜蛋白和目的蛋白結合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
3. 鎳柱堵了怎么辦？
（1）柱子發生堵塞，可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心。
（2）上清純化時，蛋白發生變性，有絮狀物產生，趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進行)，還不行加尿素變性，使其在變形環境下。
（3）樣品處理時的料液比不要太小，否則黏度大，或者導致蛋白析出或變性，料液比要在1/10-1/15 之間較適宜。
4. 純化過程中，蛋白出現了渾濁，怎么辦？
（1）出現渾濁，說明蛋白處在不穩定的環境中或者自身就不穩定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑 DTT。
（2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現象。
5. 如何處理樣品，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）？
（1）上清樣品處理，要加入去污劑，蛋白酶控制劑，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數。
（2）去大腸桿菌自身帶（兩條 30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸浮（加入去垢劑），離心 6000r/min,30min,10℃。（若效果不夠可繼續上述步驟）。
（3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可選取其中純度較佳的。
（4）可用硫酸銨沉淀法，初步提純。
6. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決？
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上，結合力較強） 策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出較佳的洗脫條件。
（2）降低 PH 的方法洗脫的,因 為若 PH 低于 3.5,會導致鎳離子脫落 策略：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
（3）蛋白已沉淀在柱上 策略：減少上樣量和孵育的時間，試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件下洗脫(用 8M 脲，或 6M 鹽酸胍)，也可在洗脫 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。
（4）非特異性疏水或其他相互反應 策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的濃度。
7. 沒能純化到帶 His 標簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？
（1）超聲的功率不對(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放) ；
策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
（2）樣品或者是結合緩沖液不正確 ；
策略：檢測 pH 及樣品和結合緩沖液的組成份（EDTA）。
（3）組氨酸的標簽沒有完全的暴露 ；
策略：在變性條件下(用 8M 脲，6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進行純化。
（4）His 標簽丟失；
策略 1：WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達，上游構建，改變his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要時增加 his 個數(常用 6-10 個)；
策略 2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間；
策略 3：改變螯合的金屬離子，尋找到較佳的結合金屬離子。
Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(組氨酸)6 標記的重組蛋白質的金屬離子，也是一般常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。
