TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)
合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到10-100倍增強(qiáng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理， 前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，后去檢測(cè)結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō)，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：480，520，570，620，690，780。此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用。可以實(shí)現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
       試劑盒組成：480熒光染料(即用型，5mL),-20℃；520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃；570熒光染料（紅光）(即用型，5mL)，-20℃；620熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；690熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；780熒光染料(即用型，5mL)，-20℃；TSA+增強(qiáng)劑，100ul，-20℃（可選）；
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗（20mL）4℃。
       備注：480熒光染料、520熒光染料、570熒光染料、620熒光染料、690熒光染料、780熒光染料在-20度下，均為固體，使用之前需解凍。

       TSA+增強(qiáng)劑使用方法：TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào)5-10倍，TSA+增強(qiáng)劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng)，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。
       操作流程：
       1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二jiabenⅠ15min-二jiabenⅡ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內(nèi)， 酒精晾干后放入自來(lái)水中稍洗，蒸餾水洗。
       2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH9.0EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)（也可以用高壓1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法）。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來(lái)確定）。
       3、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
       4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS（或者其他封閉液）均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
       5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X， 切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或者37度1-2h。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
       6、加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次， 每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。
       7、熒光染料反應(yīng)：XXX熒光染料反應(yīng)10-15min，PBS洗三次。
       8、重復(fù)2-7步驟（換用另外一種XXX熒光染料）
       9、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
       10、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
       11、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。