酶標記抗體-HRP標記抗體方法及標記步驟?
標簽：古朵生物 酶標記抗體 HRP標記抗體
酶標記抗體-HRP標記抗體方法及標記步驟?
HRP標記抗體的方法
酶與抗體交聯的方法有許多種， 根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備 HRP 結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法為常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2. 標記步驟：
(1)稱取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
(2)反應后的酶溶液經 Sephadex G-25 層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在 1 ml/1 分鐘，收集棕色流出液。如體積大于 5 ml,則以 PEG 濃縮至 5 ml。放置25 ml 小燒杯中，緩慢攪拌。
(3)將待標記的抗體 12.5 mg 用生理鹽水稀釋至 5 ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用 1M PH9.5 碳酸緩沖液 0.25 ml，繼續攪拌 3 小時。
(5)加 0.2M 賴氨酸 0.25 ml，混勻后，置室溫 2 小時。
(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置 4℃ 1 小時。
(7)3000 rpm 離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。
(8)將上述溶液裝入透析袋中，對 0.15 M PH7.4 的 PB 緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000 rpm離心 30 分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
3. 結果判定：
(1)定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定 其活性。后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定(見本節(三)工作濃度的選擇)。
(2)定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程 1 cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG 量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg/ml)IgG 量(mg/ml)酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000 IgG量(3)本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2~4% 的酶與蛋白質結合。
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