谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白純化常見問題指南


  谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）是一個含有211個氨基酸的蛋白，通常將該蛋白加入到重組蛋白的末端以便對該重組蛋白進(jìn)行純化或檢測。具有組氨酸的非融合蛋白會產(chǎn)生非特異性結(jié)合，這會阻礙組氨酸標(biāo)簽的親和純化。但GST標(biāo)簽則與之不同。由于GST對于其底物-谷胱甘肽具有*的特異性，所以可以獲得高的純度。

  另外，GST標(biāo)簽蛋白含有特殊的剪切序列，純化后使用不同的蛋白酶即可簡單的去掉GST標(biāo)簽。同時，GST標(biāo)簽蛋白的純化在非常溫和的條件下進(jìn)行，可有效保護(hù)靶蛋白的功能和抗原性。

  但是，在GST融合蛋白純化中，經(jīng)常會遇到一些問題。本專題對這些問題進(jìn)行了匯總，指出了大多數(shù)純化方法存在的普遍問題，對于特別的純化方法的問題也有提，形成了GST融合蛋白純化常見問題指南。

  問題一：目的蛋白與磁珠不結(jié)合或結(jié)合效率低

  可能原因：目的蛋白與磁珠不結(jié)合或結(jié)合效率低

  解決辦法：測序確認(rèn)，調(diào)整閱讀框以獲得GST.Tag融合表達(dá)蛋白；使用蛋白酶缺陷型大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌；如果有稀有密碼子應(yīng)采用Rosetta系列宿主菌。

  可能原因：GST融合蛋白被機(jī)械裂解的方法變性（比如超聲）

  解決辦法：過度超聲會破壞標(biāo)簽蛋白而減少其與磁珠的結(jié)合；在裂解過程中，用溫和的機(jī)械/化學(xué)裂解條件，裂解的條件必須依照經(jīng)驗(yàn)來決定。

  可能原因：GST融合蛋白在樣品中有聚集，導(dǎo)致沉淀

  解決辦法：在細(xì)胞裂解前加入DTT，在緩沖液中也加入DTT。1-20mM的DTT會顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。

  可能原因：GST融合蛋白的濃度過低

  解決辦法：濃縮樣品。結(jié)合能力具有濃度依賴性。低表達(dá)量的蛋白可能不會像高表達(dá)量蛋白那樣有效地結(jié)合磁珠。因此，濃縮樣品會提高結(jié)合。

  可能原因：標(biāo)簽蛋白可能改變了GST的構(gòu)象，因此降低了GST標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。

  解決辦法：檢測所使用的pGEX載體中GST的結(jié)合。準(zhǔn)備帶有所使用的pGEX的細(xì)胞超聲裂解物，檢測其與磁珠的結(jié)合。如果結(jié)合的很好，則可能是標(biāo)簽蛋白改變了GST的構(gòu)象，因此降低了GST標(biāo)簽蛋白的親和力。可以通過降低結(jié)合的溫度到4°C限制洗滌來改善結(jié)果。

  可能原因：結(jié)合條件不佳

  解決辦法：低于pH6.5或高于pH8時，融合蛋白與磁珠結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低，請確認(rèn)磁珠在用于目的蛋白純化前經(jīng)過pH6.5~8.0緩沖液充分的平衡。

  可能原因：磁珠使用次數(shù)過多

  解決辦法：如果已使用幾次，應(yīng)考慮磁珠再生或使用新的磁珠。

  問題二：目的蛋白不能洗脫或洗脫效率低

  可能原因：洗脫緩沖液的體積太少

  解決辦法：增加洗脫緩沖液的體積。

   谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白純化常見問題指南可能原因：洗脫的時間不夠

  解決辦法：增加洗脫緩沖液與磁珠反應(yīng)的時間。

  可能原因：洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低

  解決辦法：增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度：本方案中建議的10mM濃度對于大多數(shù)應(yīng)用來說足夠了，但是也存在例外。嘗試使用50mM Tris-HCl，20-40mM還原型谷胱甘肽，pH8.0作為洗脫緩沖液。

  可能原因：洗脫緩沖液的pH過低

  解決辦法：增加洗脫緩沖液的pH值：將pH增加到8-9會增強(qiáng)洗脫而不用提高洗脫所用谷胱甘肽的濃度。

  可能原因：洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度過低

  解決辦法：增加洗脫緩沖液中的離子強(qiáng)度，在洗脫緩沖液中加入0.1~0.2M的氯化鈉也會改善洗脫效果。

  可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了

  解決辦法：使用新鮮配制的洗脫緩沖液。

  問題三：洗脫的蛋白中有雜質(zhì)

  可能原因：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

  解決辦法：加入蛋白酶抑制劑。出現(xiàn)多條帶可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的結(jié)果。可在裂解溶液中加入1mM PMSF防止目的蛋白降解。一種的水溶性的PMSF替代物是AEBSF，Roche Biochemicals的商品名為Pefabloc SC。注：絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去。

  古朵解答可能原因：在宿主細(xì)菌中的蛋白降解

  解決辦法：多條帶可能是在宿主細(xì)菌中蛋白酶切造成的。如果是這種情況，需要使用蛋白酶缺陷型菌株（比如lon-或ompT），大腸桿菌BL21隨pGEX載體提供，這種菌株是ompT和lon缺陷型菌株。

  可能原因：細(xì)胞破碎時超聲處理過度

  解決辦法：降低裂解時間，機(jī)械裂解前加入溶菌酶（0.1倍體積的10毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0）可能會使結(jié)果變好。避免發(fā)泡，因?yàn)檫@可能使標(biāo)簽蛋白變性。過分裂解也會導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白和GST標(biāo)簽蛋白共純化。

  可能原因：分子伴侶可能被共純化了

  解決辦法：多余的條帶可能由于共純化一些分子伴侶所造成。這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋白的正確折疊。如：DnaK（分子量70 000）、DnaJ（分子量37 000）、GrpE（分子量40 000）GroEL（分子量57 000）、GroES（分子量10 000）。一些從這些共純化的蛋白中分離GST融合蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表。

  問題四：目的蛋白酶切后電泳檢測發(fā)現(xiàn)多條條帶

  可能原因：蛋白酶切發(fā)生在宿主細(xì)菌內(nèi)

  解決辦法：檢測條帶何時出現(xiàn)：如果確定多余的條帶在Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa切割前不存在，這些條帶可能是在宿主細(xì)菌中被降解的結(jié)果。目的蛋白可能含有Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa的切割位點(diǎn)，請檢查序