單抗制備常見問題分析@古朵新聞

  1. 為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低?

  答：可以從這幾個方面一一考慮：

  (1)設計的抗原與被免疫的動物內源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質。對于前一種情況應該重新設計抗原，設計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設計為短肽然后再與載體蛋白偶聯之后免疫;對于后一種情況，首先確認小分子物質是否已經正確地和載體蛋白偶聯，如果偶聯沒有問題，可以換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優先考慮的蛋白。

  (2)免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關動物免疫的部份，實際操作中的相關程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

  (3)免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮換佐劑嘗試。

  (4)免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

  (5)免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

  (6)測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗(即血清)稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

  2. 為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少?

  答：可以從這幾個方面考慮：

  (1)免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。

  (2)培養基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

  (3)培養基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。

  (4)未正確制備飼養層細胞。參見本站有關飼養層細胞制備的部份。

  (5)接種雜交瘤細胞的培養板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

  (6)融合后，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養瓶中培養，然后再滴到96孔板上。如果在培養瓶中培養的時間過長，也可能出現克隆利率少的情況。

  (7)細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

  (8)細胞培養條件不正確，確保細胞培養在恒定的37度較濕的環境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

  (9)其它與融合條件相關的不恰當的因素。詳見本站有關細胞融合的部份。

  3. 為什么融合后得不到陽性克隆?

  答：可能的原因：

  (1)動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。

  (2)融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁面第2個問題。

  (3)篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當的二抗等諸多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

  (4)抗原成份與細胞培養條件中的物質相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結構相同或類似的物質產生了競爭反應。舉個簡單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養雜交瘤的培養基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結合，后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

  (5)其它所有能影響ELISA等相關篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關ELISA實驗的講解與討論。

  4. 為什么我的細胞生長很慢?

  答：可能的原因：

  (1)使用了劣質的培養耗材、培養基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養實驗，根據骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質量。

  (2)使用的血清或培養基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

  (3)制備飼養層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。

  (4)其它問題，可以參考本頁面第二個問題。

  5. 我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉為陰性了?

  答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是穩定的，確實容易發生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復蘇操作時，容易發生陽性變為陰性。但是也有一些辦法盡量減少陽性變為陰性的辦法。一般可以從這幾個方面加以注意：

  (1)永遠保證細胞處在佳的生長環境中。尤其是培養基不能長期不換，一般來說，當細胞增長到一定密度的時候，培養基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養基了，除了換培養基，同時應該控制好細胞的密度，可以吹走過多的細胞，使新加入的培養基不至于很快被消耗。

  (2)對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。

  (3)不要過于頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現死亡或者生長形態發生明顯變化。

  (4)對于傳代次數較多的細胞株需要經常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

  (5)當細胞被支原體等微生物污染，也會發生由陽性轉為陰性的情況。

  6. 為什么我做亞克隆后長不出克隆來?

  答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

  (1)亞克隆時，原始孔里的細胞狀態不好，經過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆。

  (2)亞克隆時，沒有按照正確的數量取出細胞，在本站有關亞克隆操作的頁面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，則也可能出現長不出克隆的結果。

  (3)未添加飼養層細胞。單個細胞在完全培養基中極難培養，如果不添加飼養層細胞，則它們很可能很快就死亡，終就長不出克隆。

  (4)使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態。

  (5)使用無血清培養基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養基制備單抗，但是在某些血清可能干預篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養基來培養雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養基中，單個細胞是很難長成克隆的。好的解決辦法就是先用含有血清的培養基培養它們，等克隆長出后再把培養基徹底換為無血清培養基。

  7. 為什么我凍存的細胞很難復蘇或者復蘇不活?

  答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：

  (1)凍存液的配方。這個問題很關鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養過雜交瘤的培養基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養過雜交瘤的培養基，而盡量不要用一般的完全培養基，而且一定是配養需要凍存的那一株的培養基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發表評論。如果新手確實對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

  (2)凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復蘇成活的機會就明顯會下降。

  (3)凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是理想的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，后轉入-80 ℃放置過夜，終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現在市場上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉至液氮中即可。

  (4)細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，終可能造成細胞污染。

  (5)保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態，并且沒有被污染。

  對于復蘇過程，需要注意：

  (1)快速。為了防止升溫中細胞內產生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復蘇，并不斷晃動凍存管。

  (2)復蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復蘇的細胞被污染。

  (3)有的人復蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養體系里，容易對細胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養基重懸，再接種到新的容器內培養。

  8. 為什么我的細胞總是污染?如何可以救活污染的細胞?

  答：養細胞出現污染，幾乎是每個細胞培養技術員容易出現的問題。要防止細胞污染，無非就是保證培養環境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時提高操作時的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話了。下面講一講如何挽救一株已經被污染的細胞株。

  (1)體外用抗生素消滅。一般來說，一旦發現細胞被微生物污染，應該馬上進行處理，也許還有一線挽救的機會。 但是這種挽救不是盲目的，首先應該決斷是哪一類生物造成的污染。細胞的污染大致可以分三類：細菌污染、真菌污染和支原體污染。

  (2)體內法。這個辦法很簡單，原理就是動物體有強大的免疫系統，一般的微生物都可以被動物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣，即先用IFA或石蠟制敏小鼠，數天后腹腔注射污染的雜交瘤。如果情況緊急，致敏當天注射雜交瘤也行。一般十天后小鼠產生腹水，在超凈臺無菌采出腹水，其中即含有大量的雜交瘤細胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射雜交瘤，十幾天后可以看到實體瘤形成，也可以在超凈臺上無菌采摘，然后放回培養板或培養瓶等容器內培養。如果被污染的細胞很少，比如說在96孔板上就被污染了，這時候不能進行腹腔注射，也不要進行皮下注射，否則細胞很容易被老鼠的免疫系統攻擊而死亡的，好的辦法是采用脾內注射的方法進行，同時在腹腔內用IFA或石蠟油致敏，十幾天后，同樣可以形成腹水，其中即含有干凈的雜交瘤細胞。 如果擔心小鼠會受到微生物感染，可以在培養基中先加入高濃度的抗生素，然后連同抗生素一起注射到小鼠體內。

  如果確定細胞污染極其嚴重，并且細胞已大面積死亡，建議放棄，迅速做好環境清潔工作，對細胞操作間作徹底消毒，重新做融合而獲得新的細胞株，不可因小失大造成其它的細胞也被污染。

  9. 為什么我的雜交瘤細胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價?

  答： 不能制備腹水的原因大部份是人為的原因：

  (1)致敏不正確，例如使用了不正確的致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。

  (2)雜交瘤的接種位置不正確，沒有打到腹腔，而是打到了皮下。

  (3)接種的雜交瘤細胞數量太少或者細胞狀態不好。一般不應少于10萬個細胞，建議在100萬個細胞左右為宜。

  (4)制備腹水小鼠的種系與參與融合的細胞來源的動物種系相差太遠，以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反應將其殺死，建議換小鼠品系重新接種。

  對于腹水沒有效價，可能的原因：

  (1)制備腹水的雜交瘤極不穩定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內就失去了分泌能力。

  (2)致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑，如使用了弗氏完全佐劑，這時即使不打雜交瘤，小鼠也會產生腹水。

  (3)極其罕見的情況，就是此雜交瘤生產的抗體可以與小鼠體內的分子相互作用，于是雜交瘤產生的抗體被小鼠的相關蛋白中和，這種情況下，小鼠的身體可能會出現明顯的異常。

  (4)檢測腹水效價的實驗方案有問題，或者腹水稀釋比過大。

  10. 免疫失敗的可能原因及應采取的措施

  答：有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。

  (1)免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數量。

  (2) 抗原質量是否良好，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

  (3) 制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑，載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方面去考慮，并加以改進。

  (4) 所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

  (5) 免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

  (6) 動物的飼養是否得當，如營養(飼料、飲水)、環境衛生(通風、采光、溫度)是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

  11. 制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

  答：由于制備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

  (1)污染： 包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中辣手的問題。一旦發現有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養環境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

  (2)融合后雜交瘤不生長， 在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

  PEG有毒性或作用時間過長。

  牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。

  骨髓瘤細胞污染了支原體。

  HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

  (3)雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合后有細胞生長，但無抗體產生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變為陰性，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而 抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

  三要：

  要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

  要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。

  要定期進行再克隆。

  三不要：

  不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

  不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。

  不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。

  (4)雜交瘤細胞難以克隆化

  可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。

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