古朵技術| 質粒提取實驗步驟
實驗原理
現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質粒(<15Kb)，而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質粒(>15Kb)。
堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠大于質粒DNA，且染色體DNA為線狀分子，而質粒為共價閉合環狀分子。當pH值為 12.0-12.6，堿性環境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性且無法復性，而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可恢復其天然構象;在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA為可溶狀態，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA仍在上清中。殘留的雜質可以通過酚處理掉。
實驗過程
1、實驗試劑
(1)溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0;
(2)溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS;
(3)溶液Ⅲ 3Ml 醋酸鉀 / 2Ml 醋酸;
(4)異丙醇，無水乙醇，75%乙醇應放-20℃冰箱預冷備用;
酚放4℃冰箱預存;
(5)搖菌，2-3ml相應抗性的LB培養液，在37℃溫度下過夜培養。
2、質粒提取
(1)菌液12000rcf離心5min，棄掉上清，加入0.2ml溶液I(已加入RNase)，充分混勻后，加入0.25ml溶液II，顛倒混勻，室溫放置5min，加入0.4ml 溶液III，顛倒混勻后，13000rcf 離心30min。
(2)上清轉入新的1.5mlEP管中，加入等體積的酚混合液，充分混勻。10000rcf 離心10min。
(3)取上清，轉入新的EP管，加入等體積、預冷的異丙醇，充分混勻后，13000rcf 離心 6min。
(4)倒掉上清液，用1ml預冷的75%乙醇，顛倒后，13000rcf 離心 1min。
(5)倒掉上清液，沿壁加入1ml預冷的75%乙醇，直接倒掉。
(6)沿壁加入1ml預冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室溫下放置10min。
待管內液體會發干凈后，向管內加入100ul水，55℃孵育5min。
(7)所得質粒溶液可以放入-20℃中長期保存。
注意事項
若菌株為革蘭氏陽性菌，該菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
搖床速度不宜過高。達到OD600 1.5即可。
溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。
溶液II和溶液III使用前需注意觀察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴處理。
溶液II處理菌體時間應控制在5分鐘以內。
常見問題及解決方法
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常見問題 |
原因 |
解決辦法 |
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質粒濃度低 |
溶液處理不充分 |
增加溶液I/II/III的加入量，或降低菌液體積。 |
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質粒拷貝數低 |
增加搖菌量，并降低后的溶解體積 |
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菌體老化 |
重新質粒轉化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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乙醇殘留 |
乙醇的存在會影響質粒的溶解和回收，須延長乙醇揮發時間 |
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洗脫液不合適 |
可配置合適的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA，pH8.5） |
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洗脫體積較小 |
在保證質粒濃度的前提下，增加洗脫液的體積 |
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質粒有雜帶 |
菌液污染 |
重新質粒轉化或劃線后挑取單克隆搖菌 |
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試劑污染 |
質粒提取溶液重新配置，后溶解液高壓滅菌后使用 |
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