實驗原理：ELISA試劑常見類型-雙抗夾心法

  ELISA是以體外抗原抗體反應為基礎，將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化作用相結合的一種檢測方法，靈敏度可達皮克(pg/mL)水平。它是目前商業應用為成熟的免疫分析方法之一，在醫學實驗、臨床診斷、生物制藥方面的運用也極為廣泛。目前，常見的ELISA類型有四種：雙抗夾心法、直接法、間接法和競爭法。

  其中，雙抗夾心法是為常用的一種，分雙抗體夾心和雙抗原夾心。研域將以雙抗體夾心法為例，和大家分享相關知識~

  實驗原理

  雙抗體夾心法，其基本原理是將定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待檢標本，通過加入檢測抗體，酶標記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關。

  1 包被抗體

  許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等，在進行抗體固定化之前，需要對酶標板材進行篩選。酶標板由親水到疏水，對蛋白的結合會由強變弱，造成吸附能力的差異。將抗體吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求pH在9.0～9.6之間。蛋白質包被的適濃度需進行滴定：用不同的蛋白質濃度包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本OD值，選擇OD值大而蛋白量少的濃度。

  2 標準品及樣本

  標準品即為目標物(樣本中待檢測因子)的純蛋白，從母液稀釋到級聯稀釋都需要特別留意，標曲的制作是ELISA試劑實驗成功的關鍵。待檢目標物需具備多個抗原表位，即二價或二價以上的大分子抗原，因為這種檢測方法需要兩種抗體。另外，需要注意的是血清樣本中的類風濕因子(RF)干擾——RF能與多種動物的變性IgG的Fc部分結合而產生假陽性反應。

  3 洗滌液

  ELISA操作中會涉及到多次洗板。長時間的孵育后，會出現非特異性結合，這時就需要洗滌液來洗去非特異性結合的蛋白或抗體，通常為PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短時間洗板比少次長時間洗板有效，在后一次洗板時，盡量拍凈液體，同時注意讓板子保持濕潤。

  4 檢測抗體

  雙抗體夾心法中的檢測抗體與目標蛋白結合位點需要有別于目標物與包被抗體結合的位點，即會涉及抗體配對的問題。常用的抗體配對方法有下幾種：

  包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗;

  包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對的抗原表位不同;

  包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般來源于不同的宿主。

  5 生物素標記的二抗

  鑒于酶標二抗的局限性，現在廠家一般引入生物素親和素系統(biotin avidin system, BAS)，這種系統在提高反應靈敏度的同時，應用起來也加方便。進行生物素標記時，可依據抗體所帶可標記基團種類(氨基、醛基、巰基等)以及分子酸堿性選擇相應的活化生物素和反應條件。生物素標記后，不影響被標記物的生物活性。

  6 辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素

  每個親和素分子可與4個生物素分子結合，所以可以偶合多連接生物素的酶分子，從而大大提高了ELISA試劑實驗的靈敏度。生物素和親和素間的親和力強，二者一旦結合，就極為穩定，而且這種結合反應時間比抗原抗體反應所需時間短。在BAS檢測中多用鏈霉親和素“streptavidin, SA"，它是鏈霉菌培養過程中的分泌物，由4條相同的肽鏈組成。HRP靈敏，穩定，比活性高，分子量小，純酶容易制備。其有4對半胱氨酸形成的二硫鍵，99位Asp和123位Arg形成的鹽橋，9個潛在的糖基化位點，有兩個金屬中心，可催化顯色底物TMB產生藍色一價物。

  7 顯色底物

  由于 TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)比其他顯色底物具有高的靈敏度且無致癌性、故而被廣泛使用。HRP 或其他適當過氧化物酶能在過氧化氫存在下催化TMB生成可溶的藍色物，此時通?？稍?370nm 測定吸光度。當顯色反應被酸性溶液終止后，產物由藍色一價物轉為黃色二價物，此時可在 450nm 測定吸光度。

  實驗步驟概要：

  準備好所有的試劑和梯度稀釋的標準品。板條加入300μl 1×洗液靜置浸泡30秒。

  標準品孔加入100μl 2倍倍比稀釋的標準品。血清/血漿：空白孔加入100μl標準品稀釋液; 細胞培養上清: 空白孔加入100 μl培養基。

  血清/血漿：樣本孔加入50μl 1×檢測緩沖液和50μl 樣本 細胞培養上清：樣本孔加入100μl細胞培養上清。

  每孔加入50μl 1:100稀釋的檢測抗體。步驟2、3、4 在15分鐘內完成。

  封膜，室溫孵育2小時。洗滌6次。

  每孔加入100μl 1:100稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

  封膜，室溫孵育45分鐘。洗滌6次。

  每孔加入100μl顯色底物，避光，室溫孵育5 - 30分鐘。

  每孔加入100μl終止液。

  30分鐘內，在450nm波長檢測OD值，參考波長570nm或63nm

  注：以上步驟是以研域生物ELISA試劑盒為參考，不同廠家的試劑盒操作步驟可能不一樣，開始實驗前一定要仔細閱讀產品說明書哦~

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