古朵生物：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與步驟詳解
古朵生物：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與步驟詳解
1、細(xì)胞傳代
1)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
2)用移液槍加入1ml胰酶，消化1min(37℃，5% CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。
3)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
4)用移液槍多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。
5)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
6)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8 x 106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。
7)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
8)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
A、將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10s，溶解脂狀物。
B、震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩。
2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積ul：DNA質(zhì)量ug)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
3)將混合液在室溫放置10-15min。
4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。
6)到時(shí)間后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。
3、第二次細(xì)胞傳代
1)在轉(zhuǎn)染后24h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。
2)再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8 x 105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新分入培養(yǎng)皿中。
3)在正常條件下培養(yǎng)24h后，按照染色要求條件固定。
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