古朵快訊| 細(xì)胞凍存方法、步驟及注意事項(xiàng)
古朵快訊| 細(xì)胞凍存方法、步驟及注意事項(xiàng)
細(xì)胞越來越受廣大科研者的喜愛，但細(xì)胞不像人們想象中那么強(qiáng)大，在培養(yǎng)復(fù)蘇等過程中稍有不慎就不可能導(dǎo)致它的死亡。而且它必須是是在無污染的條件下培養(yǎng)，復(fù)蘇才能保證實(shí)驗(yàn)效果。古朵生物公司技術(shù)為您詳細(xì)總結(jié)細(xì)胞的正確冷凍保存方法、保存詳細(xì)步驟，相關(guān)注意事項(xiàng)如下：
一、保存方法(主要有兩個(gè))：
(1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
二、步驟：
(1)冷凍前一日前換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，*后濃度為5～10%，混合均勻，置于室溫下待用。
(3)依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)：
(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90%致密度。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好，無污染
(2)冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
(3)3.一定要保證DMSO的濃度是10%，凍細(xì)胞要舍得用進(jìn)口的DMSO
(4)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
(5)慢凍,快解凍。細(xì)胞在 -15 度左右胞內(nèi)形成結(jié)晶對(duì)細(xì)胞損傷，緩慢降溫有助于減少損傷，故放入 -20 度冰箱中凍存可實(shí)現(xiàn)緩慢降溫較為方便，保存時(shí)間過久會(huì)影響細(xì)胞活力。
上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。
