原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶( HRP) 對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法， 類似常規免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗， 同樣有對應的 “顯色"步驟 (HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物， 產生 活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合， 使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光 素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物， 重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復就可實現多重標記。

  TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結合位點)， 產生大量的酶促產物， 該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、 組氨s和酪氨s殘基)結合， 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積， 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。 

  簡單來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP (而不是直接偶聯熒光素) ， 來催化后續 添加入體系的非活性熒光素。 熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯， 使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。 然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價 結合的抗體被洗掉， 共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。 再換個一抗來第二輪孵育 ， 周而復始。 等到所有抗體孵育結束， 熒光素都結合好后， 后去檢測結果。 由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。 也就是說， 如果用 TSA 技術， 同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。 搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗， 而且信號放大的倍數大大增強。 本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種： 480， 520， 570 ， 620， 690， 780， 488， CY3.此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。 可以實現單標、雙標、三標以及多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

  試劑盒組成： 488 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃; CY3 熒光染料 (紅光) (即用型， 5mL)， -20℃; TSA+增強劑， 100ul， -20℃ (可選) ;

  高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 (5mL) 4℃。

  備注： 488 熒光染料 、CY3 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

  TSA+增強劑使用方法： TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強劑： 熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強劑不是必須的選項， 可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

  試劑盒1、 石蠟切片脫蠟至水： 依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內， 酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。

  2、 抗原修復： 組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內進行抗原修復 (也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法) 。 中火 8min， 停火 8min， 轉中低火 7min， 此過程中應防止緩沖液過度蒸發， 切勿 干片。 自然冷卻后將玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定) 。

  3 、 阻斷內源性過氧化物酶： 切片放入 3%過氧化氫r液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS (PH7.4) 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。

  4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 (防止抗體流走) ， 在圈內滴加用 3%BSA-PBS (或者其他封閉液) 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。

  5、 加一抗： 輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X， 切片平放于避光濕盒 內 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 (濕盒內加少量水防止抗體蒸發)

  6、 加 hrp 二抗： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。

  7、 熒光染料反應： 488 熒光染料 (或者 CY3 熒光染料) 反應 10-15min， PBS 洗三次。

  8、 重復 2-7 步驟 (換用另外一種 熒光染料)

  9、 DAPI 復染細胞核： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。

  10、 封片： 玻片置于 PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。

  11、 鏡檢拍照： 切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖 像。

  染料 激發波長 發射波長

  DAPI 藍色 350 420

  480 450 480

  488 綠色 480-490 512-520

  CY3 紅色 530-550 570-590

  520 綠色 490 520

  570 紅色 550 570

  620 590 620

  690 630 690

  780 750 780

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