技術服務：PCR污染原因及解決方法

  一、污染原因

  1. 標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于 密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提 取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

  2. PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。

  3. PCR擴增產物污染.這是PCR反應中主要-常見的污染問題.因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

  還有一種容易忽視，可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣 槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48 000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

  4. 實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大。

  二、污染的監測

  一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

  1. 陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經自己使用穩 定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

  2. 陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

  3. 重復性試驗。

  4. 選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

  三、防止污染的方法

  1. 合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。-好能劃分：①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環擴增區;④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用。實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

  2. 吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸 樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

  3. 預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先 配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會.另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一 冰箱。

  4. 防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。

  5. 設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的低量的標準病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照 及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

  6. 減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。

  7. 選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出

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