還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)試劑盒說明書

  微量法 100T/96S

  注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

  測定意義：

  GSH是細胞內主要的抗氧化巰基物質，在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等中具有重要作用。還原型與氧化型比值(GSH/GSSG)是細胞氧化還原狀態的主要動態指標。因此，測定細胞內GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。

  測定原理：

  DTNB與GSH反應生成復合物，在412nm處有特征吸收峰;其吸光度與GSH含量成正比。

  自備儀器和用品：

  低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

  試劑組成和配制：

  試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

  試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

  試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

  粗酶液提取：

  組織：按照組織質量(g)：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例(建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

  細菌、真菌：按照細胞數量(104個)：試劑一體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一)，冰浴超聲波破碎細胞(功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min);然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

  血清等液體：直接測定。

  GSH測定操作：

  1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到412 nm，蒸餾水調零。

  2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中保溫30min。

  3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A1。

  4. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL試劑二，40μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A2。

  注意：空白管只需要測定一次。

  GSH含量計算公式：

  GSH標準曲線公式：y=1.5 x(x為GSH濃度，μ mol /mL;y為吸光值)

  a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

  (1)按蛋白濃度計算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣×Cpr) =0.667×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按樣本質量計算

  GSH(μ mol/g 鮮重)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=0.667×(A2-A1) ÷W

  (3)按細胞數量計算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數量)=0.667×(A2-A1) ÷細胞數量

  (4)按液體體積計算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷1.5×V樣÷V樣 =0.667×(A2-A1)

  V反總：反應總體積，0.2mL;V樣總：上清液總體積，1 mL;V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL;W：樣品質量

  b.使用96孔板測定的計算公式如下

  GSH標準曲線公式：y=0.75x(x為GSH濃度，μ mol /mL;y為吸光值)

  (1)按蛋白濃度計算

  GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷V樣÷Cpr =1.334×(A2-A1) ÷Cpr

  (2)按樣本鮮重計算

  GSH(μ mol/g 鮮重)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=1.334×(A2-A1) ÷W

  (3)按細胞數量計算

  GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷0.75×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數量)=1.334×(A2-A1) ÷細胞數量

  (4)按液體體積計算

  GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷0.75×V反總÷V樣 =1.334×(A2-A1)

  V樣總：上清液總體積，1mL;V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL;Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL;W：樣品質量，g。

  注意事項：

  試劑一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

  低檢出限為0.011mmol/L。

  還原型谷胱甘肽試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。