技術(shù)原理：免疫熒光染色原理及步驟
技術(shù)原理：免疫熒光染色原理及步驟
免疫熒光又稱免疫熒光抗體。免疫熒光實(shí)驗(yàn)原理是將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對(duì)使用標(biāo)記抗體用量偏大。利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
下面古朵生物詳細(xì)介紹免疫熒光染色步驟：
1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間(參考：30min)。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時(shí)振蕩。
4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+"表示：(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱，但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++--++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++"以上，而各種對(duì)照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽性。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟：
一、細(xì)胞準(zhǔn)備：
對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
二、固定和透化
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。
3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細(xì)胞15 min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟), 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。
三、封閉
4. 吸水紙吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清(與二抗種屬來源一致或相似)，室溫封閉1 h。
四、抗體孵育
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
五、固定拍照
7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
免疫熒光染色 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。
