實驗原理解析：石蠟切片免疫組化染色步驟

  1、載玻片的處理：

  抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：

  1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。

  1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。

  1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。

  2、常用酶消化：

  2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。

  2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin(層粘蛋白)，Collagen IV(IV型膠原)等。

  2.3 皂素(Saponin)：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。

  3、抗原熱修復：

  可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。

  3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘(注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘(注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型)。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

  3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后)，計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

  3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

  4、免疫組化染色步驟：

  4.1石蠟切片脫蠟至水。

  4.2 3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

  4.3蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復，可在此步后進行)。

  4.4 5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。

  4.5 PBS沖洗，5分鐘×3次。

  4.6滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

  4.7 PBS沖洗，5分鐘×3次。

  4.8滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

  4.9 PBS沖洗，5分鐘×3次。

  4.10顯色劑顯色(DAB或AEC)。

  4.11自來水充分沖洗，復染，封片。

  冰凍切片免疫組化染色步驟

  冰凍切片4~8mm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。

  石蠟切片免疫組化染色步驟

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