古朵生物總結(jié)：夾心ELISA實驗操作步驟

  一、關(guān)于夾心ELISA

  夾心ELISA測定兩層抗體(即捕獲抗體和檢測抗體)間的抗原。靶抗原必須包含至少兩個能夠結(jié)合到抗體的抗原位點。單克隆或多克隆抗體均可在夾心ELISA系統(tǒng)中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進(jìn)行定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

  夾心ELISA去掉了分析前的樣品純化步驟，提高了靈敏度(比直接或間接法靈敏2–5倍)。

  二、實驗步驟

  1.用捕獲抗體包被

  ①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。

  ②未純化抗體(例如腹水液或抗血清)可能需要增加樣品蛋白質(zhì)的濃度(嘗試用10μg/mL)補(bǔ)償濃度低的特異性抗體。

  ③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。

  ④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?

  2.封閉和加樣

  ①每孔添加 200μL 封閉緩沖液(5% 脫脂奶粉/PBS)封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。

  ②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時，或在4℃下孵育過夜。

  ③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。

  ④將100 μL 稀釋樣品添加到每個孔。通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號。每板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品(兩重測定或三重測定)和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標(biāo)準(zhǔn)品濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動態(tài)檢測范圍?？赡苄枰獌?yōu)化濃度范圍以獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采取兩重測定或三重測定。

  ??⑤移除樣品，用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。

  3.用檢測抗體和二抗孵育

  ①將100μL稀釋的檢測抗體添加到每個孔。?確保檢測抗體識別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對抗體結(jié)合的干擾。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。

  ②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時。

  ③用PBS洗滌微量滴定板四次。

  ④添加100μL偶聯(lián)二抗，使用前將其在封閉緩沖液中稀釋。

  ⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時。

  ⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。

  三、檢測

  考慮到某些生物材料具有高水平內(nèi)源酶活性(例如肺泡細(xì)胞中的高水平ALP、紅細(xì)胞中的高水平過氧化物酶)，這可能會導(dǎo)致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑(針對ALP)或用0.3% H2O2的甲醇溶液(針對過氧化物酶)進(jìn)行另外的阻斷處理。

  ALP底物

  對硝基苯磷酸鹽(pNPP)是大多數(shù)應(yīng)用常用的底物。室溫孵育15–30分鐘后在405 nm處測定硝基苯酚呈現(xiàn)的黃色，并加入等量0.75M NaOH 終止反應(yīng)。

  HRP顯色液

  HRP的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯(lián)，反應(yīng)期間氫供體的氧化使顏色發(fā)生變化。

  TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)

  將TMB溶液添加到每個孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4)，然后在450nm 處讀取光密度。

  某些酶底物被認(rèn)為是有害的(潛在致癌物)，因此應(yīng)始終小心處理并佩戴手套。

  四、數(shù)據(jù)分析

  由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在X軸(對數(shù)標(biāo)度)上，而吸光度標(biāo)在Y軸(線性標(biāo)度)上。通過內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。

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