IHC(P) 免疫組化石蠟切片操作規程

  (一)、儀器設備

  1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐;

  2)水浴鍋

  (二)、試劑

  1)PBS緩沖液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

  2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB，pH6.0，1000ml)：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。

  3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA?2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。

  4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。

  5)酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

  6)3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

  7)封裱劑：

  a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0～9.5)等量混合;

  b、油和TBS(或PBS)配制。

  8)TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本;pH7.0～7.4適合于光學顯微鏡標本。

  (三)、操作流程

  1、脫蠟和水化

  脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

  1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，換二甲苯后再浸泡10分鐘;

  2)無水乙醇中浸泡5分鐘;

  3)95%乙醇中浸泡5分鐘;

  4)70%乙醇中浸泡5分鐘;

  2、抗原修復

  用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

  1)抗原熱修復

  (1)高壓熱修復 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

  (2)煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

  (3)微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

  2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘;胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

  抗原修復注意事項：

  1)載玻片的處理：

  抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用PES、Poly-L-Lysine等試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：

  1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。

  1.2 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。

  2)常用酶消化：

  2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。

  2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin(層粘蛋白)，Collagen IV(IV型膠原)等。

  2.3 皂素(Saponin)：一般使用濃度為2~10?g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。

  3)抗原熱修復：

  可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。

  3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘(注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘(注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型)。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

  3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后)，計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

  3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

  3、免疫組織化學染色

  SP法

  1)脫蠟、水化;

  2)PBS洗2～3次各5分鐘;

  3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘;

  4)PBS洗2～3次各5分鐘;

  5)抗原修復;

  6)PBS洗2～3次各5分鐘;

  7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

  8)滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

  9)4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。

  10)PBS洗3次各5分鐘;

  11)滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時;

  12)II抗中可加入0.05%的tween-20。

  13)PBS洗3次各5分鐘;

  14)DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度;

  15)PBS或自來水沖洗10分鐘;

  16)蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化;

  17)自來水沖洗10～15分鐘;

  18)脫水、透明、封片、鏡檢。

  SABC法

  1)脫蠟、水化。

  2)PBS洗兩次各5分鐘。

  3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。

  4)抗原修復。

  5)PBS洗5分鐘。

  6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

  7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時(4℃過夜后在37℃復溫45分鐘)。

  8)PBS洗三次每次2分鐘。

  9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。

  10)PBC洗3次每次2分鐘。

  11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

  12)PBS洗4次每次5分鐘。

  13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。

  14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。

  15)脫水、透明、封片、鏡檢。

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