干貨分享：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的種類及原理

  ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三種必要的試劑：

  ①固相的抗原或抗體;②酶標(biāo)記的抗原或抗體;③酶作用的底物。

  根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

  一、雙抗體夾心法

  雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法，操作步驟如下：

  (1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

  (2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

  (3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。

  (4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

  根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。

  二、雙位點(diǎn)一步法

  在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。

  在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

  三、間接法測(cè)抗體

  間接法是檢測(cè)抗體常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

  (1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

  (2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。

  (3)加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體問接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

  (4)加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

  本法只要換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。

  四、競(jìng)爭(zhēng)法

  競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。操作步驟如下：

  (1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。

  (2)待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量。

  (3)加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多，故顏色深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

  五、捕獲法測(cè)IgM抗體

  血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括特異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下：

  (1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。

  (2)加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

  (3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。

  (4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。

  (5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應(yīng)。

  六、應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

  親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素。生物素又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素-羥基琥珀亞胺酯(BNHS)可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素醫(yī)學(xué)教丨育網(wǎng)整理化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。

  親和素-生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過親和素-生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素-酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。

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