一步法反轉錄-熒光定量試劑盒

  本制品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進行Real Time One Step RT-qPCR的專用試劑。使用本制品進行Real Time One Step RT-qPCR反應可在同一反應管內連續進行，操作簡單，避免了樣品間交叉污染的同時也提高了檢測的靈敏度。

  本試劑盒中的25×RT-PCR Enzyme Mix為TIANGEN新型逆轉錄酶(FastKing RTase)、新型抗體修飾熱啟動Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor的預混Mix形式，其中的FastKingRTase，是分子改造后的新型逆轉錄酶，特別增加了疏水motif，具有強的RNA親和性和熱穩定性，提高了該酶的逆轉錄效率和對具有復雜二級結構RNA模板的延伸能力;PCR過程中采用了性能優良的新型熱啟動Taq DNA聚合酶，使得逆轉錄后的PCR反應具高的擴增效率和特異性。另外，本產品中的2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)是專門為上述兩種關鍵酶而優化的新型反應體系，其中包含必要離子組分、dNTPs、SYBR Green染料以及One Step 穩定劑和增強劑，可保證FastKing RTase和新型熱啟動Taq DNA聚合酶在整個一步法反應過程中發揮優良功效。

  本制品可以在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線，對多種高低豐度的靶基因進行準確定量檢測，重復性好，可信度高。

  產品特點：

  提高反應效率：性能優良的逆轉錄酶和Taq酶保證了高的反應效率;

  操作簡單快速：雙組分的產品形式使得操作過程變得簡單快速;

  通讀復雜模板：能夠作用于GC含量高，二級結構復雜的RNA模板;

  樣品普適性高：對不同物種來源及雜質較多的RNA模板的適用性高。

  用戶自己需要準備的

  1. 引物;

  2. 模板;

  3.一次性手套及其它耗材;

  適用范圍

  RT-qPCR技術可用于檢測細胞和組織中的基因表達水平及RNA病毒的含量。

  操作步驟

  1. 完全融化模板RNA，特異性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)，50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暫離心后置于冰浴上。

  2. 按下表在冰浴條件下配制反應液：

  組成成分 體積/反應

  2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μl

  25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μl

  上游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1

  下游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1

  RNA模板 10 pg-1 μg total RNA

  50×ROX Reference Dye*2 根據不同儀器添加

  RNase-Free ddH2O 補水至50 μl

  總體系 50 μl

  *1 引物終濃度為0.25 μM可以在大多數體系中獲得良好的擴增結果。擴增效率不高時，可增加PCR反應體系中的引物濃度;發生非特異擴增時，可適當減少PCR反應體系中的引物濃度。需要進一步優化引物濃度的，可以在0.05-0.90 μM范圍內調整。

  *2 幾種常見儀器的匹配ROX Reference Dye濃度見下表：

  儀器 終濃度

  ABI 5700/7000/7HT/StepOneTM/

  StepOne PlusTM

  5×(例如：5 μl ROX/50 μl體系)

  ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7、QuantStudio 、

  12K Flex;Agilent Mx3000P、Mx3005P和Mx4000 1×(例如：1 μl ROX/50 μl體系)

  Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等 不用添加

  3. 進行Real Time One Step RT-qPCR反應

  PCR反應管請用離心機瞬時離心后放入熒光定量PCR儀中進行Real Time PCR反應。建議采用下列圖表顯示的標準PCR反應程序，如果使用該程序得不到良好的實驗結果時，再進行PCR條件的優化。

  注意事項

  1. RNA 模板可以采用總RNA 或mRNA，建議使用TIANGEN公司生產的TRNzol，RNAprepPure或RNA Easy Fast系列制備高質量的總RNA。

  2. 一步法RT-qPCR實驗應避免RNase污染，可采用以下措施：

  1) 因人的皮膚表面和唾液都有RNase，因此實驗中應佩戴一次性手套和口罩;

  2) 一步法RT-qPCR實驗應使用專門的儀器和耗材，建議在專門區域操作RNA;

  3) 一步法RT-qPCR實驗相關耗材應用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃處理12 h，并高壓滅菌30 min后使用。

  3. 25×RT-PCR Enzyme Mix在取用之前應短暫離心收集溶液后再吸取，吸取時動作要慢，使用后應盡快放回-20℃。

  4. 2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)在取用前應充分混勻并離心后使用。

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