ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果不顯色是什么原因?qū)е?/h1>

發(fā)布時(shí)間：2023-11-23 閱讀：290次

  ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果不顯色是什么原因?qū)е?

  有很多一些新手ELISA試驗(yàn)人員來說，試驗(yàn)做得不理想是難免的事。這不，就在近期一個(gè)朋友找古朵生物小編咨詢。這位朋友說道：“初度用間接法做ELISA試驗(yàn)，做了幾回結(jié)果都沒有顯色，原因在哪里呢”

  可能原因一：

  1.包被原：包括你的包被液有無問題，有沒有配錯(cuò)。包被原一般加100微升，37度2小時(shí);

  2.關(guān)閉：關(guān)閉液用的是否合適?你說做了幾回都沒顯色，空白孔也不顯嗎?假如空白也無色彩，那關(guān)閉就沒有問題。一般關(guān)閉是200微升每孔，也能夠滿孔關(guān)閉

  3.一抗：查看你的一抗是否失效。是否是在37度反響

  4.二抗：底物，底物緩沖液……這些都要好好查看!

  5.洗刷：用PBST洗刷，包被和關(guān)閉時(shí)洗板3次;一抗二抗洗刷5次，每次間隔3分鐘。手工和機(jī)器洗刷沒什么不同，就是省力一些。洗5次不會(huì)有負(fù)影響，在一抗和二抗洗刷過程中，恰恰需求多洗幾回，這樣有助于削減非特異性吸附

  可能原因二：

  1、陽性對照不顯色

  漏加陽性對照

  陽性對照孔忘加酶或忘加顯色劑

  陽性對照受污染

  2、陽性對照顯色淺(HBeAb HBcAb陰性對照顯色淺)

  試劑和保存不當(dāng)、活性下降

  在使用前試劑盒未放置在室溫平衡

  溫育時(shí)間不夠或孵育溫度過低

  洗板浸泡時(shí)間過長、洗板次數(shù)過多

  使用不正確的洗液

  洗液中含有防腐劑同時(shí)殘留量過多

  洗板后酶標(biāo)板被干透

  讀數(shù)時(shí)使用波長不正確

  濾光片不清潔或?yàn)V光片位置錯(cuò)誤

  讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板放置位置錯(cuò)誤

  陽性對照活性下降

  酶標(biāo)失活

  3、陰性對照顯色(HBeAb、HBcAB除外)

  實(shí)驗(yàn)過程受污染

  陰性對照污染

  酶滴在孔壁上

  4、整板不顯色

  試劑和保存不當(dāng)、已經(jīng)失活

  忘記加酶、可檢查滴瓶內(nèi)酶量

  忘記加抗原或中和試劑

  忘記加顯色劑A或顯色劑B

  5、陽性對照讀數(shù)不正常

  加入標(biāo)本后未進(jìn)行必要的混勻

  標(biāo)本稀釋錯(cuò)誤

  加樣量不正確

  冷凍標(biāo)本未完全溶解混勻

  標(biāo)本中含有防腐劑

  6、血清本底高

  試劑盒靈敏度高

  加樣時(shí)使用同一槍頭、交叉污染

  孵育時(shí)間過長或溫度過高

  洗板次數(shù)不足，浸泡時(shí)間短

  洗板時(shí)洗液量少或殘留量多

  洗板時(shí)洗液量過多、串孔

  洗板機(jī)管道中有霉菌生長

  洗液瓶混用

  洗板機(jī)洗板頭阻塞或洗板機(jī)洗板頭位置錯(cuò)誤

  配置洗液的去離子水或蒸餾水被污染

  終止液濃度不夠，沒有充分混勻，或終止液被污染

  讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

  酶標(biāo)儀偏差

  7、假陽性結(jié)果

  實(shí)驗(yàn)器具被污染

  血清中出現(xiàn)纖維蛋白凝集

  血清標(biāo)本中出現(xiàn)過多的紅細(xì)胞

  血漿標(biāo)本處理不當(dāng)

  標(biāo)本中含有灰塵、顆粒或細(xì)菌等

  標(biāo)本被反復(fù)凍融

  加標(biāo)本后進(jìn)行不正確的振蕩

  沿孔壁上加入標(biāo)本，加樣后出現(xiàn)過多的氣泡

  酶標(biāo)滴加在孔壁上，洗板未洗凈

  混用洗液或洗液稀釋錯(cuò)誤

  洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌

  洗板次數(shù)不足或浸泡時(shí)間短

  洗板時(shí)洗液量少或殘留量多

  洗板時(shí)洗液量過多、串孔

  讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板底部有水蒸氣凝結(jié)

  洗液瓶、廢液瓶混用

  讀數(shù)過程中板孔中有氣泡

  酶標(biāo)儀偏差

  8、同一板內(nèi)重復(fù)性差

  標(biāo)本混勻不充分

  試劑混勻不充分

  標(biāo)本與酶結(jié)合物混勻不充分

  加樣技術(shù)差異

  加樣器故障或加樣器被污染

  加樣時(shí)間過長導(dǎo)致孵育時(shí)間不同

  孵育器內(nèi)部的溫度不一致，造成酶標(biāo)板孔間的孵育溫度差異

  讀數(shù)時(shí)酶標(biāo)板孔間有氣泡

  9、HCV血清本底高

  靈敏度高

  樣本稀釋液加液量不足100ul

  槍頭深入血清過深，致使外壁沾有血清導(dǎo)致加樣偏多(>10ul)

  同一孔加了兩次樣本

  其他可能原因參考HBsAg

  10、HIV陽性對照低

  誤將陽性對照稀釋

  陽性對照未混勻

  加液量不足

  其他可能原因參考HBsAg

  11、HIV血清本底高

  標(biāo)準(zhǔn)變，靈敏度提高

  標(biāo)本稀釋液加液量不足100ul

  槍頭深入血清過深，致使外壁沾有血清導(dǎo)致加樣偏多(>10ul)

  同一孔加了兩次樣本

  其他可能原因參考HBsAg

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