載體的一些基礎知識以及如何閱讀質粒圖譜
載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒DNA是一種新的非病毒轉基因載體。這里主要介紹下一個合格質粒的組成要素、載體的一些基本知識以及如何閱讀質粒圖譜。
一、一個合格質粒 的組成要素
復制起始位點Ori 即控制復制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段P/E 啟動子/增強子Terms 終止信號加poly(A)信號 可以起到穩定mRNA作用。
二、如何閱讀質粒圖譜
步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。
(1)Ampr 水解β-內酰胺環，解除氨芐的毒性。
(2)tetr 可以阻止四環素進入細胞。
(3)camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418(長那霉素衍生物)失活
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號
啟動子-促進DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子-負增強子，負調控序列。
核糖體結合位點/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs)：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG(起始密碼)和SD序列。
轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子：結構基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly(A)加尾信號。結構基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly(A)加尾信號。
回答有人之前提出的一個問題：為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三、介紹一下關于載體的知識
1.什么是載體
即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞)，需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體(vector)。P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。
2.載體的分類
按功能分成：(1)克隆載體 都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段(基因)的載體。(所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹行載體)
(2)表達載體 具有克隆載體的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
按進入受體細胞類型分：(1)原核載體 (2)真核載體 (3)穿梭載體(sbuttle vector)指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因(穿梭往返兩種生物之間).
P.S.穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。
3.基因工程載體的3個特點：
(一)都能自主的復制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
(二)都能便利的加以檢測： 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。
(三)都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。
4.載體的選擇和制備：
選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】.載體的類型：
(1)克隆載體的克隆能力-據克隆片段大小(大選大，小選小)。如<10kb選質粒。
(2)表達載體據受體細胞類型-原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
(3)對原核表達載體應該注意3點：
①選擇合適的啟動子及相應的受體菌;
②用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位;
③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。
選用質粒(常用)做載體的4點要求：
①選分子量小的質粒，即小載體(1-1.5kb)→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多(也有大載體);
②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地;
④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(試一試)。
一、一個合格質粒 的組成要素
復制起始位點Ori 即控制復制起始的位點。原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。
抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段P/E 啟動子/增強子Terms 終止信號加poly(A)信號 可以起到穩定mRNA作用。
二、如何閱讀質粒圖譜
步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。
(1)Ampr 水解β-內酰胺環，解除氨芐的毒性。
(2)tetr 可以阻止四環素進入細胞。
(3)camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418(長那霉素衍生物)失活
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。
啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號
啟動子-促進DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子-負增強子，負調控序列。
核糖體結合位點/起始密碼/SD序列(Rbs/AGU/SDs)：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG(起始密碼)和SD序列。
轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子：結構基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly(A)加尾信號。結構基因的后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly(A)加尾信號。
回答有人之前提出的一個問題：為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
三、介紹一下關于載體的知識
1.什么是載體
即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞)，需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體(vector)。P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。
2.載體的分類
按功能分成：(1)克隆載體 都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段(基因)的載體。(所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹行載體)
(2)表達載體 具有克隆載體的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。
按進入受體細胞類型分：(1)原核載體 (2)真核載體 (3)穿梭載體(sbuttle vector)指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因(穿梭往返兩種生物之間).
P.S.穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。
3.基因工程載體的3個特點：
(一)都能自主的復制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。
(二)都能便利的加以檢測： 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。
(三)都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。
4.載體的選擇和制備：
選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。
載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】.載體的類型：
(1)克隆載體的克隆能力-據克隆片段大小(大選大，小選小)。如<10kb選質粒。
(2)表達載體據受體細胞類型-原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
(3)對原核表達載體應該注意3點：
①選擇合適的啟動子及相應的受體菌;
②用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位;
③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。
選用質粒(常用)做載體的4點要求：
①選分子量小的質粒，即小載體(1-1.5kb)→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多(也有大載體);
②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個。
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地;
④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr(試一試)。
