古朵生物| 細胞HE染色實驗指南
古朵生物| 細胞HE染色實驗指南
做干細胞三系分化實驗的小伙伴，想必對油紅O染色、茜素紅染色和阿利辛蘭染色法很熟悉了，今天來介紹另一種細胞實驗常用的染色方法，即蘇木精——伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining)，簡稱HE染色法。
HE染色基本原理
細胞核染色原理
蘇木精為堿性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內染色質的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。
細胞漿染色原理
細胞漿內主要成分是蛋白質，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系，當pH調到蛋白質等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或堿性染料不易染色。當pH調到6.7一6.8時，大于蛋白質的等電點pH值，表現酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現時胞核也被染色，核和胞漿難以區分。因此必須把pH調至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽離子)，就可被帶負電荷(陰離子)的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷(陽離子)結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。
細胞HE染色流程
培養的細胞HE染色過程與組織切片的染色過程基本相同，包括樣品制備、染細胞核、染細胞質、脫水、透明、封固和觀察等步驟。
1樣品制備
細胞：取細胞密度約為1×105/mL接種于含蓋玻片的培養瓶中，放入CO2培養箱中培養一段時間，待細胞基本長成單層，取出長有細胞的蓋玻片，用PBS洗3次。
2染細胞核
a. 固定
將蓋玻片浸入95%乙醇固定15min，PBS洗2次，每次1min;
浸入蘇木精染液，染色5~10min。b. 分色
自來水浸洗，浸入稀鹽酸乙醇溶液進行分色，數秒鐘即可;
自來水浸洗，浸入淡氨水中，使胞核藍化3~5min;
自來水浸洗。
03染細胞質
a. 浸入伊紅染液，染色5~10min;
b. 自來水浸洗;
4、脫水
逐級脫水：經70%、80%、90%乙醇各脫水1次，95%乙醇脫水2次，百分百的乙醇脫水3次，每次1min。
4、透明
二甲苯透明3次，每次1min。
4、封固
在載玻片上滴加中性樹膠，將有細胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。
4、觀察
光鏡下觀察，細胞質呈粉紅色，細胞核呈藍紫色。
注意事項
1.染色時調節pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
2.切片染蘇木精后，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚(晰)而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。
3.切片經酒精脫水后，入二甲苯時可出現白色不透明狀態，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。
4.在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經元形態。
5.切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。
6.zui后封固時，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。
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