古朵淺談酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)實(shí)驗(yàn)方法
古朵淺談酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)實(shí)驗(yàn)方法
酶聯(lián)免疫測(cè)定是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，發(fā)展建立一種非放射性標(biāo)記免疫分析方法。由于ELISA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作方法簡(jiǎn)便快速、無放射性污染以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究，病毒學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)等工作中應(yīng)用十分廣泛。
該法需將純化的抗原包被在固相載體，與一定稀釋度的待側(cè)血清反應(yīng)，然后與酶標(biāo)記的第二抗體(抗人IgG,IgA,IgM或抗人IgG.A.M的混合物)反應(yīng)，酶可催化色原反應(yīng)，在酶標(biāo)測(cè)定儀一定波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，測(cè)定吸光度。
ELISA試劑盒的關(guān)鍵是要具備高質(zhì)量純化或重組的抗原，對(duì)生產(chǎn)廠家的抗原要求很高。由于純化的或重組的抗原越來越多，以及商品化的高質(zhì)量的ELISA試劑盒的面市，它應(yīng)用于臨床免疫實(shí)驗(yàn)室的自身抗體的檢測(cè)已日漸增多，該法檢測(cè)自身抗體快速、敏感及特異性高。
一、免疫熒光法----自身抗體診斷的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(IFA)
免疫熒光測(cè)定法可分為直接和間接兩類，在自身抗體檢測(cè)中，以間接免疫熒光法為常用。由于自身抗原的位置決定了其相應(yīng)的抗體的典型熒光模式，該法能通過顯微鏡觀測(cè)地判斷組織或細(xì)胞內(nèi)熒光的分布。
將已稀釋血清與實(shí)驗(yàn)基質(zhì)進(jìn)行溫育，令特異性抗體與實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中相應(yīng)抗原結(jié)合，然后再與熒光標(biāo)記的第二抗體溫育，后在熒光顯微鏡下觀察相應(yīng)部位的特異性熒光模式。
此方法敏感、重復(fù)性好。但需要一臺(tái)質(zhì)量較好的熒光顯微鏡，且對(duì)操作人員要較高，操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，繁瑣。
二、免疫印跡法(Immunoblot assay)(westerblot)
此法是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白及多肽與免疫反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。蛋白質(zhì)在電泳中依分子量大小分離，然后將分離好的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維薄膜上，用酶標(biāo)記的抗體或蛋白A進(jìn)行染色。該法簡(jiǎn)單、快速。是目前美國(guó)、中國(guó)等上眾多國(guó)家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的終確認(rèn)方法。但其制備方法繁瑣、成本相對(duì)較高。
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