干貨分享：抗體的制備方法與原理

  一、抗血清的制備

  有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩剑拍墚a(chǎn)生質(zhì)量好(特異性強(qiáng)和效價(jià)高)的抗體。

  (一)用于免疫的動(dòng)物

  作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無(wú)感染性疾患，好為///雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。若用兔，好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

  (二)免疫途徑

  免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

  (三)佐劑

  由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。

  佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

  常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9(V/V)，這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

  配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔叭〉热莘e完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液(其中加卡介苗3～4mg/ml或不加)，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來(lái)回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

  (四)免疫方法

  抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，首次免疫時(shí)皮下注射百日*疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日*疫苗。

  在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)(見(jiàn)后)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止(圖2-3)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

  圖2-3 抗體反應(yīng)

  (五)抗血清的采集與保存

  家兔是常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱(籠)外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開(kāi)皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過(guò)程中要嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。

  收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過(guò)夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm,10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝(0.05～0.2ml)，貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

  (六)抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

  在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。

  1.效價(jià)  抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子(如蛋白類)抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為。而后者則粗糙得多。

  (1)放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000。抗血清的效價(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。(測(cè)定方法見(jiàn)第8章 )

  (2)雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

  球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過(guò)濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，加入疊氮鈉(NaN3)，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔(圖2-4)。中央孔內(nèi)加適量抗原(容量為50μl)，周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無(wú)沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度(圖2-5)。

  2.特異性測(cè)定

  抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來(lái)表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來(lái)判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率(B/T或B/B0)，求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。

  S=y/Z×

  S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時(shí)抗原濃度，Z：IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。

  如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無(wú)限大，可以說(shuō)這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無(wú)交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。

  3.親合力   在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾(L/mol)。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的小檢出量(靈敏度)的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。

  計(jì)算親合常數(shù)的方法20余種，計(jì)算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況，只能作為參考。

  (七)免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

  有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

  (1)免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。

  (2)抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

  (3)制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

  (4)所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

  (5)免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

  (6)動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)(飼料、飲水)、環(huán)境衛(wèi)生(通風(fēng)、采光、溫度)是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。

  二、單克隆抗體的制備

  1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個(gè)高度的新紀(jì)元。

  免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個(gè)抗原決定簇，用它免疫動(dòng)物將產(chǎn)生對(duì)各個(gè)決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖而來(lái)的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對(duì)某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體(McAb)的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見(jiàn)2-3。

  表2—3 單克隆抗體(McAb)和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較

  項(xiàng)目常規(guī)免疫血清抗體McAb

  抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性

  抗體的結(jié)合力特異性識(shí)別多種抗原決定簇特異性識(shí)別單一抗原決定簇

  免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一

  特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一

  有效抗體含量0.01～0.1mg/ml(小鼠腹水)0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水)

  0.5～10.0μg/ml(培養(yǎng)物上清液)

  用于常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)可用單抗組合應(yīng)用

  抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu)(沉淀反應(yīng))容易形成一般難形成

  抗原抗體反應(yīng)抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可逆可形成2分子反應(yīng)，可逆

  單克隆抗體的制備方法如下。

  (一)動(dòng)物的選擇與免疫

  1.動(dòng)物的選擇  純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開(kāi)展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。

  2.免疫方案   選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

  (1)可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

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